Desenvolvimento de novas ferramentas moleculares para identificação de Paracoccidioides spp. - Pinheiro, Breno Gonçalves [UNIFESP] (2020)
Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica à toda a América Latina, sendo o Brasil responsável por aproximadamente 80% de todos os relatos de casos. A doença é considera como uma grande ameaça à saúde pública, afetando um a três novos pacientes por 100.000 habitantes anualmente. É adquirida pela inalação de propágulos de agentes etiológicos pertencentes ao complexo Paracoccidioides brasiliensis (S1, PS2, PS3 e PS4) ou P. lutzii. Agentes de PCM apresentam uma notável sobreposição fenotípica e uma grande variação antigênica, características que podem interferir no diagnóstico clássico utilizando ferramentas morfológicas e no diagnóstico sorológico baseado na detecção de antígenos circulantes. Portanto, a maioria das técnicas disponíveis até o momento, são laboriosas, consomem tempo considerável e não são suficientes para reconhecer as entidades crípticas. Para superar esses problemas, este estudo propõe duas novas ferramentas diagnósticas baseadas em detecção molecular de biomarcadores de DNA, para identificar e diferenciar entre espécies biológicas de Paracoccidioides. O primeiro ensaio consiste em uma PCR convencional espécie-específica cujo alvo é o éxon 2 do gene da GP43 (glicoproteína de 43 kDa). Os iniciadores PbraCx-F e PbraCx-R direcionados ao DNA de P. brasiliensis produzem um amplicon de 308 pb, enquanto os iniciadores Plu-F e Plu-R direcionados ao DNA de P. lutzii geram um amplicon de 142 pb. O limite inferior de detecção para o ensaio de PCR duplex foi de 1 pg de DNA genômico. Um painel de 62 DNA de Paracoccidioides revelou 100% de especificidade (AUC=1.000, 95% CI 0,972–1,000, P <0,0001), sem reagir de forma cruzada com DNAs de outros fungos de relevância médica ou DNA humano. O segundo ensaio é baseado na PCR quantitativa em tempo real (qPCR) usando sondas de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET), que atuam de forma espécie-específica ou gênero-específica cujo alvo é a região ITS (espaçador interno transcrito) localizada no DNA ribossomal. Desenvolvemos iniciadores moleculares gênero específico (Paracoco-F e Paracoco-R) e três sondas de hidrólise com especificidade para reconhecer o gênero (Paracoco-VIC) e espécies em Paracoccidioides (Pbra-FAM e Plu-NED). As concentrações dos iniciadores/sonda, a eficiência de qPCR e vários aditivos de PCR foram avaliados e otimizados. Um painel de 77 Paracoccidioides foram usados para avaliar a especificidade analítica da qPCR (AUC=1.000, 95% CI 0,972–1,000, P <0,0001). Não observamos falsos positivos ao utilizarmos DNAs de outros fungos de relevância médica ou DNA humano. Todas as eficiências de reações permaneceram entre 98,43–102,97%, com os valores de ciclo limiar (Ct) obtidos abaixo do vigésimo ciclo (mediana= 15). O limite inferior de detecção utilizando gDNA foi de 0,01fg-10fg para P. brasiliensis e 1fg-10fg para P. lutzii. O limite inferior de detecção utilizando amplicons ITS foi de apenas 3 cópias. Nossos ensaios são úteis para detectar e diferenciar membros do complexo P. brasiliensis e P. lutzii, fornecendo ao laboratório clínico ferramentas importantes a serem aplicadas na rotina, especialmente em casos atípicos, como aqueles com sorologia negativa e resultados micológicos positivos, bem como para a investigação de casos putativos de coinfecção. Isso provavelmente beneficiará milhares de pacientes que são infectados todos os anos em uma ampla área das Américas.