Histonas H2B.V e H4.V de Trypanosoma cruzi: investigação sobre a abundância, localização celular e genômica e interação com a cromatina - Rosón, Juliana Nunes [UNIFESP] (2023)
Trypanosoma cruzi é um parasita flagelado causador da doença de Chagas que possui particularidades na expressão gênica, como a transcrição policistrônica. Alterações na conformação da cromatina podem ocorrem pelas modificações pós-traducionais de histonas (MPTs) e deposição de histonas variantes, podendo alterar a expressão gênica. Dados proteômicos quantitativos indicaram que a histona variante H2B.V de T. cruzi está aumentada nas formas tripomastigotas celulares (TCTs) quando comparado às formas epimastigotas. No presente trabalho objetivou-se compreender o possível papel regulatório de duas histonas variantes, H2B.V e H4.V, na estrutura da cromatina e na expressão gênica, avaliando suas abundâncias, níveis de afinidade com a cromatina e localizações genômicas e nucleares nos ciclos celular e de vida. Primeiramente foi identificada uma putativa H4.V de T. cruzi (TcCLB.511681.20) por meio análises in silico. Foram geradas linhagens de parasitas H2B.V-myc e ty1-H4.V por CRISPR-Cas9. Por meio da localização genômica, a putativa H4.V de T. cruzi foi confirmada como H4.V por possuir localização específica principalmente nas cSSRs, em alguns loci de tDNAs, em regiões teloméricas e em genes RHS e trans-sialidases localizados principalmente nas extremidades dos contigs. Quanto a localização genômica da H2B.V, foi detectada enriquecimento nas dSSRs, em alguns loci de tDNAs e em regiões entre os compartimentos genômicos denominados conservado e disruptivo. Nos dados de ChIP-seq da H2B.V, foi observado que as formas TCTs apresentaram pouco enriquecimento em relação às formas epimastigotas, tal resultado mostra-se contraditório em relação aos dados proteômicos já publicados. Assim, foi observado os níveis de interação das histonas variantes com a cromatina, e avaliado que ambas as variantes se apresentam mais ligadas à cromatina nas formas epimastigotas e metacíclicas, enquanto nas formas TCTs está fracamente ligada a cromatina, justificando o possível desligamento da histona H2B.V durante o ensaio de ChIP-seq das formas TCTs. Em adição, foi verificado por ensaios de western blot que a H2B.V está mais abundante nas formas metacíclicas seguida das formas amastigotas, tripomastigotas e epimastigotas. A H4.V está mais abundante nas formas metacíclicas, seguida das formas epimastigotas, enquanto nas formas amastigotas e TCTs encontra-se pouquissimamente abundante. No ciclo celular verificou-se que ambas as variantes possuem marcação nos ensaios de IFA crescente das fases G1 para G2, enquanto a maior abundância de H2B.V está em G1 e S, e da H4.V está em G2 e G2/M. A integração dos resultados desta tese indica que cada variante participa de um cenário diferente do genoma e da cromatina, podendo influenciar atividades da maquinaria de RNA polimerase II, dado que se localizam em regiões associadas ao início e final de transcrição e aos telômeros. Por fim, o fato da abundância e interação com a cromatina das variantes serem distintas entre as formas de vida e fases do ciclo celular do parasita indicam que esta regulação possa ser dinâmica.