Desenvolvimento, caracterização e estudos da autofagia e apoptose em modelo celular de doença de Parkinson - Erustes, Adolfo Garcia [UNIFESP] (2018)
A Doença de Parkinson (DP) é uma doença crônica progressiva, caracterizada pela morte de neurônios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta do cérebro. A principal característica patológica da DP é a presença de agregados proteicos citoplasmáticos, chamados Corpos de Lewy, sendo o principal componente a proteína αsinucleína (αsin). Sua função ainda pouco compreendida, acreditase que atue na exocitose de vesículas de neurotransmissores e na regulação da fisiologia e morfologia mitocondrial. A αsin é comumente encontrada na sua forma selvagem (WT), contudo mutações no gene SNCA, leva a formação de proteínas mutantes, como a A30P e A53T, ambas ligadas a casos autossômicos dominantes da DP. O acúmulo e agregação destas proteínas no citoplasma dos neurônios afetados podem promover estresse celular, disfunções mitocondriais e morte neuronal. A enzima Transglutaminase2 (TG2) demonstra ter papel importante na formação de agregados proteicos em processos neurodegenerativos, uma vez que pode mediar reações de conjugação proteica. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma linhagem celular neuronal superexpressando as αsin (WT, A30P e A53T) e verificar a ocorrência de disfunções mitocondriais, alterações no potencial de membrana mitocondrial e na homeostase do Ca2+, bem como o acúmulo mitocondrial destas proteínas. Além disso, estudar os processos de autofagia e mitofagia nestas linhagens, bem como estas podem mitigar os efeitos citotóxicos promovidos pela superexpressão das αsin, e entender a correlação da αsin e TG2 na formação dos agregados e nas vias de degradação destas proteínas. Para tanto, foram utilizadas técnicas de microscopia de fluorescência em tempo e espaço reais, microscopia confocal, ensaios de coimunoprecipitação e de western blot. Os resultados mostraram que as αsin formaram agregados no citoplasma celular, especialmente na presença da TG2, já que esta pode mediar este processo, favorecendo a oligomerização destas proteínas. Os agregados apresentaram se parcialmente colocalizados com as mitocôndrias, onde afetaram o potencial de membrana mitocondrial, desregulação na homeostase e acúmulo mitocondrial de Ca2+. Houve ainda aumento na sinalização da mitofagia na presença das αsin A30P e A53T. A superexpressão causou a diminuição da atividade autofágica, e a inibição da degradação proteica causa acúmulo de monômeros e oligômeros da αsin. Desta forma, os dados sugerem que falhas nos mecanismos de degradação proteica influenciaram na oligomerização e no acúmulo das αsin; além da TG2, que também pode influenciar neste processo. Além disso, o acúmulo citoplasmático das αsin influenciou na fisiologia mitocondrial, com sensibilização do potencial de membrana mitocondrial, interferência na homeostase do íon Ca2+, inibição da autofagia e aumento nas proteínas sinalizadoras da mitofagia, especialmente na presença das αsin mutantes A30P e A53T.