Analise comparativa da atividade dos inibidores de tirosina kinase por meio da modulação da via gsk-3 beta

• Ano de defesa: 2013
• Autor(a) principal: Silva, Janaina Peixoto da [UNIFESP]
• Orientador(a): Trindade, Claudia Bincoletto [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300002chx3
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: tirosina kinase; modulação da via gsk-3 beta; morte celular; leucemia mielóide
• Link de acesso: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=90328; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48968

A Leucemia Mielóide Crônica é uma neoplasia hematológica mieloproliferativa, caracterizada por uma anormalidade cromossômica específica, a BCR-ABL, que se encontra constitutivamente ativa, sendo responsável pela ativação de diversas vias de sinalização, tais como: Ras, NF-kβ, STAT5 e PI3-K/Akt. A identificação da proteína BCR-ABL permitiu o estabelecimento de uma nova terapia com inibidores de tirosina quinase (ITK) de primeira (Mesilato de Imatinibe - MI) e segunda geração (Nilotinibe - NTB). Entretanto, o tratamento prolongado pode conduzir o paciente à resistência, diminuindo a efetividade terapêutica sendo, portanto, importante a associação com outros fármacos. Estudos recentes demonstraram que os inibidores de glicogênio síntase kinase 3 (GSK-3) induzem apoptose e inibem a proliferação de células leucêmicas, sem interferir na proliferação de células-tronco hematopoiéticas normais, sugerindo um novo alvo terapêutico para o tratamento das leucemias. Diante do exposto, avaliamos se os inibidores de GSK-3β seriam capazes de aumentar a atividade dos ITKs. Para isso, foram definidas primeiramente as concentrações dos ITKs, MI (10μM) e NTB (5μM), pelo estudo da citotoxicidade em células K-562, utilizando o ensaio de viabilidade celular por marcação com azul de tripano. A concentração do inibidor de GSK-3β LIT, foi definida após a análise do ciclo celular por meio da citometria de fluxo por marcação com iodeto de propídeo (PI). Embora o LIT não tenha aumentado à fase SubG1 de forma significativa, o mesmo foi capaz de inibir o ciclo celular na fase G2/M. Desta forma, foi definida a concentração do inibidor de GSK-3β, LIT (20mM), a ser utilizada nesse estudo. Diante disso, foram estudadas as associações de NTB+LIT e MI+LIT pelo ensaio de viabilidade celular por marcação com azul de tripano, citometria de fluxo com marcação para PI e citometria de fluxo com marcação para Anexina-V FITC, a fim de analisar a citotoxicidade, o ciclo celular e os estágios de morte celular, respectivamente. A associação de NTB ao LIT conduziu as células k-562 à morte celular de forma significativa, entretanto, a associação de MI ao LIT não apresentou o mesmo padrão de resposta, bloqueando apenas a fase G2/M. Interessante que ao analisar os ensaios de ativação de caspase-3, verificamos que as associações de LIT aos ITKs ativaram parcialmente caspase-3 quando comparado ao LIT, sugerindo que a associação também poderia iniciar a morte celular caspase-independente. Para avaliar se a inibição da proliferação celular estaria relacionada com a modulação da via GSK-3β, foram analisadas as proteínas GSK-3β fosforilada e total. Diante dos resultados, observamos que as associações de LIT aos ITKs inibiram a proliferação celular por intermédio da fosforilação e inibição da via GSK-3β. Vale ressaltar que ambas as associações reduziram a concentração da proteína BCR-ABL. Um fato importante foi a drástica redução no número de colônias pelo tratamento com LIT e sua associação ao MI em ensaios clonogênicos. Embora NTB tenha reduzido completamente o número de colônias, o LIT manteve o mesmo padrão de resposta do NTB, após a associação. Os dados apresentados neste trabalho sugerem que a inibição da via da GSK-3 pelo LIT, potencializa os efeitos citotóxicos e antiproliferativos do NTB e MI, respectivamente. Estudos estão em andamento para elucidar mais precisamente os mecanismos celulares envolvidos no aumento da atividade dos ITKs pelos inibidores de GSK-3β e sua inter-relação com a apoptose e morte celular caspase-independente.