Identificação de atividade metalo-oligopeptidásica Thimet-like em Paracoccidioides brasiliensis: um novo fator de patogenicidade fúngica? - Gravi, Ellen Tihe [UNIFESP] (2010)
Paracoccidioides brasiliensis (Pb), é uma micose sistêmica grave com formas aguda e crônica. As proteases ou peptidases são enzimas proteolíticas que ocorrem em todos os organismos e correspondem a 1-5% de seus conteúdos genéticos. Estas enzimas estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem durante a invasão metastática de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Um número reduzido de proteases do Pb já foram isoladas e caracterizadas, tampouco sua atividade durante o desenvolvimento da doença foi determinado, e até o momento, nenhuma atividade oligopeptidásica foi descrita nesse fungo. No presente trabalho foi demonstrada a presença de uma atividade metalo-peptidásica thimet oligopeptidase (TOP)-like no extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis, isolado 18 (Pb18). Nossos resultados mostraram a hidrólise do peptídeo com supressão intramolecular de fluorescência Abz-GFSPFRQ-EDDnp pelo extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis. Esse substrato é clivado preferencialmente pela TOP de mamíferos, e corroborando esse resultado, observou-se a inibição da hidrólise desse peptídeo por ο-fenantrolina e JA-2, inibidores seletivos de metalo-proteases e TOP, respectivamente. Utilizando-se peptídeos e inibidores seletivos para diferentes proteases, não se detectou a presença de atividade neurolisina-like ou neprilisina-like, e também se descartou a presença de serino-peptidases, cisteíno-peptidases e enzima conversora da angiotensina I. A maior atividade enzimática do extrato citosólico sobre os outros preparados (membrana/parede celular ou lisado total das leveduras) pode indicar uma localização citosólica dessa enzima. Não foi observada a secreção da peptidase no sobrenadante de cultura in vitro, mesmo após adição de soro fetal bovino. Todavia, a peptidase com atividade TOP-like de Pb parece ser secretada in vivo, ou liberada após lise do fungo por componentes efetores da resposta imune, uma vez que anticorpos capazes de inibir a atividade peptidásica são encontrados em soros de pacientes com paracoccidioidomicose, e soros com maior título em imunodifusão contém maiores concentrações de anticorpos enzima-específicos. Várias enzimas da família M3 clivam bradicinina, importante mediador inflamatório in vivo. A hidrólise da bradicinina e do substrato Abz-GFSPFRQEDDnp pelo extrato citosólico de P. brasiliensis, gera os mesmos fragmentos observados após clivagem pela TOP de mamíferos, que são diferentes dos gerados pela clivagem com MIP de mamíferos e OpdA bacteriana, sendo mais um indicador da presença majoritária de uma peptidase com atividade TOP-like em P. brasiliensis. A clivagem da bradicinina pela metalooligopeptidase com atividade TOP-like de Pb, poderia ocorrer no sítio inflamatório e poderia estar envolvida na inibição da indução de uma resposta imune protetora contra o fungo, favorecendo a permanência do mesmo no hospedeiro. Observamos ainda que o gene homólogo de TOP em P. brasiliensis é quase duas vezes mais expresso no virulento em comparação ao não virulento. O aumento da hidrólise do substrato Abz-GFSPFRQ-EDDnp também foi observado no isolado de maior virulência quando comparado ao de menor virulência. A possível relação entre a expressão da metalooligopeptidase com a virulência do fungo sugere que essa peptidase possa ser classificada como um fator de virulência fúngica, no entanto experimentos complementares são necessários para sua confirmação. A expressão da gp43 também foi analisada no isolado virulento e não virulento e observou-se uma expressão aumentada em até treze vezes no primeiro. Para melhor caracterização dessas metalo-oligopeptidases é necessária a obtenção da proteína recombinante, ou da proteína purificada nativa, isolada do lisado fúngico. Não obtivemos sucesso na expressão das proteínas recombinantes, tampouco no isolamento da peptidase nativa por métodos cromatográficos. Nossos resultados sugerem a presença de uma atividade metalooligopeptidásica TOP-like na fração citosólica de leveduras de P. brasiliensis. Liberação in vivo dessa enzima após a lise de fungos ou secreção estimulada por fatores do hospedeiro, pode ter um papel na inflamação e desenvolvimento da micose.