Caracterização de vesículas extracelulares exportadas pelo fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis: Identificação de componentes proteicos, lipídicos e de epitopos de carboidratos - Vallejo, Milene Carmes [UNIFESP] (2012)
Este trabalho resultou no estudo de vesículas extracelulares do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis na fase de levedura. Estas estruturas foram caracterizadas nos isolados Pb3 e Pb18 que pertencem a grupos filogenéticos diferentes e provocam um perfil distinto de infecção em camundongos B10.A. Vesículas extracelulares de 20 a 200 nm transportam antígenos, como visto nas reações de immunoblot com soro de pacientes com paracoccidioidomicose. Um novo epitopo de α-galactosil foi identificado nas vesículas extracelulares, como também na parede celular e em vacúolos intracelulares P. brasiliensis. Proteínas do sobrenadante de cultura do isolado Pb18 foram separadas em frações de vesículas (ves) e livre de vesículas (ves-free), e analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Foram identificadas, com dois ou mais peptídeos, 205 proteínas de vesículas, contra 260 de ves-free incluindo 120 compartilhadas. A proporção de proteínas de vesículas e ves-free classificadas como secretadas foi aproximadamente 70%, a maioria utilizando o transporte por vias não convencionais. Analisamos proteínas das frações de vesículas de P. brasiliensis com ortólogos em vesículas de H. capsulatum, C. neoformans e S. cerevisiae. Foram identificadas 72 proteínas de vesículas de Pb18 (35%) com ortólogos em pelo menos duas das outras espécies analisadas. Entre elas, sequências que participam de processos metabólicos de carboidrato e proteína, atividade antioxidante, tradução, sinalização e transporte foram enriquecidos nas vesículas. Com esse trabalho, fornecemos uma comparação completa com outros proteomas de vesículas fúngicas e ampliamos a visão sobre proteomas extracelulares em fungos. Nossa análise lipidômica identificou 36 espécies de fosfolipídeos nas vesículas extracelulares dos isolados Pb3 e Pb18, incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletalonamina, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidilinositol e fosfatidilglicerol. O ácido graxo C18:1 predominou nas vesículas do Pb3, enquanto nas vesículas de Pb18 o C18:2 foi mais abundante. O esterol predominante nas vesículas de Pb3 e Pb18 foi o brassicasterol, seguido por ergostetol e lanosterol. Foram identificadas nas vesículas dos dois isolados 2 espécies de monohexosilceramidas. As preparações de vesículas de ambos os isolados foram capazes de estimular a produção de citocinas em macrófagos RAW264.7. A produção de TNF-α foi maior em células estimuladas com vesículas do Pb3, ao contrário da expressão de IL-10 que foi maior ao estímulo com vesículas de Pb18. Acreditamos que nosso trabalho adiciona dados ao entendimento futuro da biologia das vesículas extracelulares, incluindo sua biogênese e função na interação patógeno-hospedeiro.