Participação de eIF2α e sua fosforilação durante o ciclo de vida e sobrevivência de Trypanosoma - Machado, Fabricio Castro [UNIFESP] (2018)
Tripanossomatídeos regulam a expressão gênica majoritariamente em nível póstranscricional através de processamento, exportação e estabilidade dos mRNAs e pelo controle da síntese proteica. Para regular o início da síntese, o fator eucarioto de iniciação 2 (eIF2) pode ser fosforilado na serina 51 da subunidade α (eIF2), reduzindo a disponibilidade de ribossomos carregados com o tRNA iniciador e diminuindo a tradução global. Unicamente em tripanossomatídeos, o Nterminal de eIF2 é estendido reposicionando a sua fosforilação regulatória para uma treonina na posição 169 (T169). Nesta tese, foi avaliado como a fosforilação varia durante o ciclo de vida de tripanossomatídeos, em especial do Trypanosoma cruzi, protozoário parasita causador da doença de Chagas. Verificouse que em T. cruzi os níveis totais de eIF2α diminuem relativamente entre as formas infectivas e não replicativas, denominadas tripomastigotas, e as formas que se multiplicam no intestino do inseto vetor ou no interior das células de mamífero. Este resultado é convergente com a diminuição da tradução global nas formas infectivas. Também verificamos que a fosforilação de eIF2 aumenta gradualmente nas formas proliferativas intracelulares antes da diferenciação em tripomastigotas. Para avaliar o papel da regulação pela fosforilação de eIF2 no ciclo de T. cruzi, foram gerados parasitas superexpressores de eIF2α com substituições nos sítios de fosforilação por alanina, um aminoácido não fosforilável. Verificamos que a presença desse eIF2 mutado em T169 desregula a síntese proteica durante o ciclo do parasita, mantendo a expressão constitutiva de glicoproteínas comuns às formas tripomastigotasmetacíclicas. Os parasitas mutados infectam menos e proliferam mais lentamente no interior das células de cultura, resultando também em menor infectividade em camundongos. Além disso, a mutação em T169 produziu parasitas mais suscetíveis ao benznidazol, reforçando que a fosforilação de eIF2 esteja envolvida no controle da expressão gênica e na resposta ao estresse em T. cruzi. Por esta razão, testamos compostos derivados de ureia previamente utilizados para inibir a replicação de células cancerígenas através da indução de fosforilação em eIF2. De 25 compostos testados, apenas o composto I17 inibiu 50% da proliferação parasitária com concentrações entre 1 a 3 μM contra todas as formas replicativas de T. cruzi e T. brucei, além de possuir seletividade 10 a 20 vezes maior para os parasitas em relação as células de mamífero. Verificamos que I17 afeta de maneira reversível as formas replicativas, parando o ciclo celular na fase G1 e reduzindo a síntese proteica global. Como este composto foi menos eficaz em T. brucei contendo somente T169 substituída por alanina, e este efeito parece ser dependente da expressão de uma proteína quinase específica denominada TbK3, podemos inferir que sua atuação, ao menos parcialmente, é através da indução da fosforilação de eIF2α nesses parasitas. Como conclusão desta tese, revelamos que a via de fosforilação de eIF2 é importante nas transições do ciclo de vida, ao menos para o T. cruzi, e pode ser explorada no entendimento e desenvolvimentos de terapias para as doenças de Chagas e do sono.