Análise genética do gene da enterotoxina east1 em amostras de escherichia coli enteropatogênica (epec) - Silva, Lucas Emanuel Pinheiro da [UNIFESP] (2014)
O gene astA que codifica a enterotoxina termo-estável de Escherichia coli enteroagregativa (EAST1) se encontra distribuído amplamente entre amostras de E. coli diarreiogênica, incluindo a E. coli enteropatogência (EPEC). Entretanto, não basta simplesmente hibridar as amostras com a sonda astA, pois o gene astA pode estar mutado através da substituição ou deleção de nucleotídeos nos oito primeiros códons, incluíndo o códon de iniciação. Em um estudo, foi verificado que 100% de amostras de E. coli enterohemorrágica (EHEC) O26, O111, O145 e O157 examinadas apresentavam o gene astA mutado nos oito primeiros códons. Desta forma, este estudo teve como objetivo analisar as sequências do gene astA em nossa coleção de amostras de EPEC típica (tEPEC) e atípica (aEPEC), bem como tentativas de se identificar novas variantes do gene astA. Um total de 54 (24,3%) amostras, 11 (15,7%) tEPEC e 43 (28,3%) aEPEC, foram positivas nos ensaios de PCR utilizando primers que correspondem às extremidades 5´ do gene astA da amostra protótipo de E. coli enteroagregativa (EAEC) 042. Todas as 54 amostras amplificaram um fragmento de aproximadamente 289 pares de bases, conforme o esperado. O sequenciamento dos 54 produtos de PCR mostrou que 25 amostras, 7 tEPEC e 18 aEPEC, possuíam o gene astA intacto idêntico ao da amostra de EAEC 042. Um subgrupo de sete amostras de aEPEC possuíam uma nova variante da sequencia do gene astA com substituição de 4 nucleotídeos, sendo designada variante EAST1v5. O restante das 22 amostras apresentou o gene astA mutado, sendo que em um subgrupo de 9 amostras, 1 tEPEC e 8 aEPEC, as mutações eram idênticas aquelas das amostras de EHEC, através da substituição ou deleção de nucleotídeos nos oito primeiros códons. Os resultados de RT-PCR mostraram que 32 amostras foram positivas para a expressão do gene astA, sendo as 25 amostras que possuíam o gene astA intacto e as 7 que possuíam a variante EAST1v5. Os ensaios de hibridização demonstraram a presença da sequência astA no plasmídio EAF das amostras de tEPEC, e em plasmídios de massa molecular compatível com o do pEAF em 12 amostras de aEPEC. Amostras de tEPEC e aEPEC portadoras do gene astA intacto foram ncontradas significantemente mais em crianças com diarréia (14,3%) do que em crianças assintomáticas (1,8%) (P = 0,011). Concluíndo, a presença do gene astA intacto entre amostras de EPEC, sugere um possível envolvimento da toxina EAST1 como um fator de virulência adicional de EPEC.