Estudo de sistemas para incorporação de aminoácidos não canônicos em proteínas recombinantes expressas em E. coli, e potencial de aplicação - Santos, Fellipe Bronze dos [UNIFESP] (2020)
A incorporação de aminoácidos não canônicos em proteínas tem se mostrado uma ferramenta cada vez mais útil e versátil, sendo realizada por substituição global ou sítio dirigida pela utilização de pares ortogonais. Está sendo cada vez mais difundida para a adição de novas características a proteínas, em estudos de microscopia, RMN ou difração de Raios-X. Neste trabalho descrevemos alguns desafios para a utilização dos aminoácidos não canônicos (AANC) e análogos de aminoácidos. Demonstramos a metodologia de substituição global de uma maior gama de aminoácidos por modificações no protocolo de expressão, utilizando vetores sob promotor T7. Onde foi descrita a metodologia que verificou a incorporação em torno de 80% do 5-Hidroxi Triptofano (BBRC).Foi mostrado o desenvolvimento de um par ortogonal capaz de bio-incorporar análogos de triptofano “volumosos” como 5-Bromo Triptofano e 5-NO2Triptofano não incorporados pela triptofanil-tRNAsintetase da E. coli.Uma vez que a triptofaniltRNAsintetase de L. lactispode incorporar tais análogos, foi transferido para a E. coli o anticódon de triptofano substituído pelo códon de parada âmbar para a perda de identidade com o códon original do Triptofano. Testes mostraram que a triptofanil-tRNAsintetase de L. lactis não reconhece o Trp-tRNA de E. coli, porém, o Trp-tRNA de L. lactis é reconhecido pela sintetase de E. coli. Utilização de resíduos de p-NO2-fenilalanina (pNF) bio-incorporadosna TimetOligopeptidase (TOP) através de um par ortogonal proveniente de Methanococcusjannaschii, em posições específicas. Sendo utilizados como uma sonda supressora da fluorescência de um resíduo específico de triptofano através da formação de par FRET (Trp-pNF) para monitorar alterações conformacionais na TOP.