Imunobiologia da proteína 2 de superfície de amastigotas (ASP-2) de Trypanosoma cruzi - Claser, Carla [UNIFESP] (2008)
Estudos pré-clínicos de vacinação mostram que a Proteína 2 de Superfície de Amastigotas (ASP-2) é um alvo importante para a imunidade protetora contra a infecção pelo Trypanosoma cruzi. Baseado nestas propriedades protetoras da ASP-2, nós pensamos que seria importante avaliar o seu polimorfismo nas diferentes cepas do parasita. Utilizando anticorpos policlonais e monoclonais contra a proteína recombinante da cepa Y, nós confirmamos a presença de epítopos associados a ASP-2 em amastigotas das cepas pertencentes ao grupo T. cruzi II (Y), T. cruzi I (Sylvio X10/4, Dm28c, Tulahuén, G e Colombiana) e na cepa híbrida (CL-Brener). A estrutura primária da ASP-2 em cada cepa diferente foi determinada a partir de cDNAs de amastigotas intracelulares. A comparação da estrutura primária da ASP-2 expressa pelas cepas Y, CL-Brener, Tulahuén, G (G2) e Colombiana confirmou os dados imunológicos revelando um alto grau de identidade entre eles (>82%). Por outro lado, a ASP-2 das cepas Sylvio X10/4 e G (G1) apresentaram uma identidade limitada em relação às outras cepas (<50%), mas um alto grau de identidade quando comparadas entre si (78,7%). Os estudos de vacinação confirmaram os dados estruturais. Camundongos altamente susceptíveis A/Sn imunizados com cDNAs das cepas Y (pIgSPclone9) ou CL-Brener (pIgSPclone50) apresentaram um grau semelhante de proteção contra desafio com a cepa Y. Em contrapartida, o cDNA da cepa G (pIgSPclone62, G1) foi significativamente menos efetivo. Dessa forma, nossos estudos forneceram evidências que a ASP-2 expressas por diferentes cepas de T. cruzi compartilham um alto grau de identidade estrutural e imunológica. Entretanto, há na natureza algumas poucas cepas que apresentam formas distintas desta proteína. Para estudar a possível função biológica da ASP-2, nós avaliamos inicialmente a ligação da proteína recombinante em células de mamíferos em cultura. Apesar desta proteína se ligar nas células em cultura, parasitas transfectados expressando a ASP-2 na sua superfície não induzem a mobilização de Ca+2 intracelular em célula HeLa, um fenômeno importante na invasão de células hospedeiras. xviii A ASP-2 contém um domínio C-terminal denominado FLY (VTVXNVFLYNR) que foi demonstrado interagir com a citoqueratina (CK18), uma proteína abundante no citoplasma da célula hospedeira. Baseado nesta informação, nós propusemos que a interação do domínio FLY da ASP-2 com a CK18 seria um passo crítico para a multiplicação do T. cruzi no citoplasma da célula hospedeira. RNAi foi utilizado para diminuir a expressão de CK18 em células HeLa in vitro e após 24h de transfecção, as células foram infectadas com tripomastigotas das cepas Y, CL-Brener ou Sylvio X10/4 de T. cruzi. A redução dos níveis do mRNA e da proteína da CK18 decorrentes da transfecção com RNAi, foram determinados por PCR em tempo real, Western blot e imunofluorescência. Seguindo a infecção por tripomastigotas de T. cruzi, nós não observamos uma redução significativa na porcentagem de células infectadas, indicando que a invasão dos parasitas não foi significativamente alterada pela ausência de CK18. Contudo, as células transfectadas com RNAi específicos para a CK18 e infectadas com tripomastigotas das cepas Y ou CL-Brener, apresentaram uma redução significativa no número de parasitas intracelulares 48 horas após a infecção quando comparados a células controles. Em contraste, a expressão reduzida de CK18 não afetou o número de parasitas intracelulares da cepa Sylvio X10/4. Experimento de dupla marcação mostrou que os parasitas da cepa Y, mas não da cepa Sylvio X10/4, co-localizam junto com a CK18. A redução nos níveis de CK18 não afetou a ligação da proteína recombinante His-65kDa à célula HeLa, nem a indução da fosforilação de ERK1/2 por esta proteína. Dessa forma, nossos estudos demonstraram que o RNAi pode ser utilizado para reduzir a expressão de CK18 in vitro em células HeLa e que a inibição de CK18 não interfere na invasão do T. cruzi, mas reduz a multiplicação das formas intracelulares de cepas que co-localizam com a CK18. Além disso, nossos resultados demonstraram que a CK18 não é necessária nem para a ligação da proteína recombinante a células HeLa nem para a ativação da via de sinalização de ERK1/2 induzida pela ASP-2.