Organização e expressão dos genes H49/calpaína que codificam um antígeno imunodominante de Trypanosoma cruzi - Carabantes, Alexandra Lena Galetovic [UNIFESP] (2009)
Em nosso laboratório foi isolado um clone recombinante de T. cruzi, denominado H49, que codifica repetições de 68 aminoácidos (aa) dispostas em tandem. Estas repetições são encontradas em um antígeno imunodominante de aproximadamente 240 kDa que está envolvido na ligação do flagelo ao corpo do parasita, conhecida como zona FAZ. Este trabalho relata a caracterização da estrutura do gene e da proteína H49. Buscas no banco de dados de T. cruzi utilizando o algoritmo BLAST revelaram que as repetições de 68 aa são encontradas em uma região central de oito calpaínas-like cisteínas peptidases. Em duas dessas, as repetições H49 são altamente conservadas e organizadas em tandem. Nas outras seis calpaínas-like encontradas, as repetições eram degeneradas e podem ser separadas por pequenas seqüências não repetitivas. Essas proteínas apresentaram domínios característicos de cisteínas proteinases cálciodependente, como Cys-Pc e Calpain_III. A associação entre as seqüências H49 e calpaína foi confirmada por amplificação por PCR e análises de clones de YAC utilizando oligonucleotídeos específicos para amplificar regiões especificas de calpaína e repetições H49. O locus H49 foi mapeado no clone CL Brener utilizando uma sobreposição de clones de YAC. A associação da repetição H49 e calpaínas nos YACs foi demonstrada por PCR e por análise de restrição. Corroborando com dados obtidos, a análise por “chromoblot” revelou que as sondas H49 e calpaína hibridizam com as mesmas bandas cromossômicas. Nossos dados indicam que as repetições H49 fazem parte de um subgrupo de genes da calpaína e, portanto, denominados H49/calpaína. Recentemente uma nova família de proteínas associadas ao citoesqueleto foi descrita em Trypanosoma brucei e Leishmania. Estas proteínas são caracterizadas por sua similaridade com a região catalítica da calpaína, assim como pela presença de seqüências de aminoácidos repetidas em tandem que apresentam similaridade de 30-40% com a repetição H49. Esses resultados sugerem que a aquisição da calpaína, contendo repetições pelos tripanossomatídeos (talvez por fusão de genes) foi um evento tardio na evolução dessa família de proteínas. Para avaliar a ocorrência e a distribuição subcelular da proteína H49/calpaína em epimastigotas, diferentes domínios da calpaína e da repetição de 68 aa foram expressas em bactérias, as proteínas foram purificadas e utilizadas na imunização de coelhos e camundongos. Os anticorpos policlonais purificados foram utilizados para estudar a organização e distribuição subcelular das repetiçãos de 68 aa e calpaína em T. cruzi. Em “immunoblotting”, anticorpos contra o domínio calpaína e contra as repetições de 68 aa reagiram com uma proteína de 240 kDa presente no extrato total de epimastigotas. Anticorpos anti-calpaína reagiram com bandas adicionais de aproximadamente 170, 60 e 56 kDa que correspondem a calpaínas sem as repetições de 68 aa. Análise de imunofluorescência revelou que a proteína H49/calpaína está localizada apenas na região de adesão entre o corpo celular e o flagelo. A calpaína, além de ser encontrada no flagelo, também é encontrada no citoplasma. Além disso, a H49/calpaína associada ao citoesqueleto colocalizou com marcadores da zona de adesão flagelar (FAZ). Domínios repetitivos da H49/calpaína contem alfa hélices (“helix-turn-helix”) que poderiam estar organizadas em uma estrutura enovelada em uma estrutura “coiled-coil”. Sugerimos que as proteínas H49/calpaína formariam um homodímero que poderia ligar a membrana do flagelo à membrana do corpo celular na zona de adesão flagelar.