Caracterização, clonagem e expressão de um inibidor de elástase de neutrófilo humano, purificado de sementes de Caesalpinia echinata (pau-brasil) - Cruz-Silva, Ilana [UNIFESP] (2006)
As proteases são enzimas que participam de diversos processos biológicos, como a liberação de peptídeos biologicamente ativos, a coagulação sangüínea, a fibrinólise e a cascata do complemento, mas também de processos patológicos, como a doença de Alzheimer, artrite e edema. Dentre essas enzimas, a elastase é uma das mais destrutivas do corpo, e quando não controlada por seus inibidores endógenos, pode causar danos irreversíveis. No edema pulmonar, os inibidores endógenos de elastase são incapazes de regular sozinhos a ação da enzima. E como os vários inibidores exógenos utilizados no tratamento desta patologia têm apresentado diversos efeitos colaterais, é justificada a pesquisa de novos inibidores de elastase que não apresentem estes efeitos. Por serem essenciais à vida, os inibidores são encontrados em todos os organismos. Dentre as plantas, as leguminosas são as que apresentam grandes quantidades de inibidores em sementes, frutos e raízes. O nosso laboratório vem isolando e caracterizando diferentes enzimas e inibidores de Caesalpinia echinata (pau-brasil), uma leguminosa muito importante na história do Brasil, e os objetivos desse trabalho foram: caracterizar um inibidor de elastase de neutrófilo humano extraído das sementes dessa planta, clonar o gene que codifica este inibidor e expressar o inibidor recombinante. As sementes descascadas foram trituradas e homogeneizadas em uma solução salina. Após fracionamento por acetona, cromatografia de troca iônica, filtração em gel e cromatografia de fase reversa, obteve-se um inibidor do tipo Kunitz, de cadeia única, de aproximadamente 23 kDa, capaz de inibir elastase de neutrófilo humano (Ki=1,9 nM) e diminuir a pressão da artéria pulmonar e a formação de edema em um modelo experimental em coelho. O fragmento de cDNA de CeEI, de aproximadamente 700 pb, foi clonado a partir de RNAm de sementes imaturas de C. echinata. Nelas constatou-se a presença de mais de um gene codificante para inibidor de elastase; porém, ambas as proteínas recombinantes apresentaram seqüências e constantes de inibição para elastase de neutrófilo humano e quimotripsina semelhantes, sugerindo que possa existir mais de uma isoforma desse inibidor nesta planta. Nos últimos anos, técnicas em Biologia Molecular, como a clonagem de proteínas e as mutações dirigidas, proporcionaram uma vasta ampliação no conhecimento de inibidores de proteases. As ferramentas geradas nesse trabalho poderão ser utilizadas na geração de novos inibidores mais específicos, por meio de mutações dirigidas no sítio reativo, para aplicações práticas não só na Medicina, mas também na Agricultura.