Estudo da expressão do receptor P2X7 e da síntese de óxido nítrico em célula mesangial imortalizada de camundongo em meio com glicose alta - Fernandes, Thamires de Oliveira [UNIFESP] (2015)
Diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica não-transmissível caracterizada por hiperglicemia; esta danifica diversos tecidos como o endotélio, levando à doença vascular e nefropatia diabética (ND). As células mesangiais (CM) presentes nos glomérulos são uma fonte de óxido nítrico (NO) e desenvolvem um papel importante na progressão da ND. CMs possuem diversos receptores, entre eles encontramos os receptores purinérgicos. Em nosso laboratório demonstramos que o receptor P2X7 estava altamente expresso no DM, entretanto quando o estresse oxidativo foi controlado, houve a recuperação do NO renal e os níveis de ativação desse receptor estavam significantemente reduzidos. E por esse motivo, objetivou-se estudar a expressão do receptor P2X7 e a síntese de NO em cultura de célula mesangial imortalizada de camundongo (CMiC), cultivada em meio com glicose alta. CMiC foram cultivadas em meio de cultura - DMEM, suplementado com 5% de soro bovino fetal e mantidas em placas alojadas em incubadora a 37ºC com 5% de CO2. Após atingirem 50% de confluência, as células foram cultivadas em meio com concentração normal de glicose (NG ? 5mmol/L); glicose alta (HG ? 30mmol/L) ou manitol (MA -30mmol/L) por 72 horas. Após esse período, a viabilidade celular foi avaliada por um contador automatizado; o sobrenadante foi coletado para quantificação direta do NO (?mol/mg proteina) e a proteína foi analisada por Western blot para verificação da expressão das isoformas endotelial e induzível da NOS (eNOS e iNOS), caspase-3 e P2X7. A viabilidade celular manteve-se próxima dos 95% em todos os grupos, sem demonstrar diferença;contudo, houve significante aumento da proliferação celular no grupo HG quando comparado com os demais grupos. Os níveis de NO estavam aumentados no grupo HG (134 ±18) quando comparado com os grupos MA (62 ±17) e NG (62 ±16), todos com p<0,05. O grupo HG também demonstrou aumento na expressão de iNOS, caspase-3 e P2X7 (0,38 ± 0,02; 0,68 ± 0,04; 1,26 ± 0,07; respectivamente) quando comparado com os grupos MA (0,19 ± 0,01; 0,41 ± 0,01; 0,90 ± 0,05; respectivamente) e NG (0,22 ± 0,02; 0,45 ± 0,02; 0,87 ± 0,05; respectivamente), todos com p<0,05; eNOS não apresentou diferença entre os grupos. P2X7 apresentou forte (r=0,8) e significante (p<0,0001) correlação positiva com o NO. Portanto, no nosso estudo observamos que glicose alta aumentou a proliferação, juntamente com a morte celular via apoptose; verificou-se ainda que houve aumento significante nos níveis de NO e que isso provavelmente ocorreu via iNOS e P2X7. Em meio com alta concentração de glicose, os níveis de adenosina trifosfato (ATP) extracelular estão elevados, contribuindo para o aumento da expressão dos receptores P2X7; estes por sua vez, são responsáveis por liberar citocinas pró-inflamatórias que estimulam o aumento da expressão da iNOS e consequentemente a síntese de NO. Em conclusão, vimos que em CMiC em meio com glicose alta a expressão do P2X7 e a síntese de NO estavam aumentadas, com forte correlação positiva entre si. Sugerimos que tais receptores desencadeiam efeitos deletérios no tecido renal e portanto, poderiam ser importante alvo terapêutico no tratamento e/ou prevenção das complicações microvasculares renais do DM.