Estudo das vias proteômicas do plasma seminal e dos espermatozoides associadas à infertilidade masculina - Lopes, Paula Intasqui [UNIFESP] (2018)
Objetivo: A composição proteica do plasma seminal e dos espermatozoides é essencial para a sua função correta e, consequentemente, para a fertilidade. Assim, estudos proteômicos vêm sendo realizados a fim de entender os mecanismos pós-genômicos subjacentes e de identificar as proteínas alteradas na infertilidade masculina. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar proteínas de plasma seminal e de espermatozoides e sua associação com alterações funcionais dos espermatozoides e com a infertilidade masculina primária ou secundária. Métodos: Este trabalho foi subdividido em dois estudos. No estudo 1, amostras seminais de 197 homens normozoospérmicos foram utilizadas. Após a coleta e liquefação do sêmen, uma alíquota foi utilizada para a análise seminal, outra para a avaliação da integridade funcional dos espermatozoides e o volume remanescente foi centrifugado para a separação do plasma seminal. Este foi então utilizado para a avaliação dos níveis seminais dos biomarcadores sugeridos: (i) de alterações na atividade mitocondrial dos espermatozoides – GSTM3, (ii) de defeitos no acrossoma dos espermatozoides – PLTP e (iii) de integridade do DNA dos espermatozoides – CRISPLD1, CRISPLD2 e RARRES1. No estudo 2, sete homens com fertilidade comprovada (n=7), nove homens com infertilidade primária (n=9) e sete homens com infertilidade secundária (n=7) foram incluídos. Após a coleta e liquefação do sêmen, uma alíquota foi utilizada para a análise seminal e o volume remanescente foi congelado a –80 °C. No momento da análise proteômica, a amostra foi descongelada e centrifugada para separação dos espermatozoides. Após a extração das proteínas dos espermatozoides, essas foram utilizadas para a análise proteômica shotgun por 1D-LC-MS/MS. As proteínas diferencialmente expressas foram utilizadas para análise de redes de interação proteína-proteína. As proteínas centrais nessas redes, envolvidas com funções biológicas alteradas em ambos os grupos de homens inférteis (BAG6, HSPA2 e SPA17), assim como as proteínas específicas de testículos (HIST1H2BA e SPA17) foram validadas nas amostras de espermatozoides. Nos dois estudos, os biomarcadores foram avaliados por Western blotting. No estudo 2, as proteínas foram também analisadas por imunocitoquímica utilizando microscopia confocal. Resultados: No estudo 1, o nível seminal da proteína GSTM3 estava aumentado em amostras com baixa atividade mitocondrial dos espermatozoides. Por outro lado, o nível das proteínas CRISPLD2 e RARRES1 estava diminuído no plasma seminal de homens com alta fragmentação de DNA dos espermatozoides. As proteínas PLTP e CRISPLD1 não variaram entre os grupos estudados. No estudo 2, um total de 1.305 proteínas de espermatozoides foram identificadas, sendo 102 diminuídas e 15 aumentadas em ambos os grupos de infertilidade. As proteínas diminuídas estavam relacionadas, principalmente, a modificações pós-traducionais e dobramento de proteínas. A proteína BAG6 demonstrou-se significativamente diminuída em homens inférteis, enquanto a proteína HIST1H2BA estava aumentada nesses pacientes. Os níveis das proteínas HSPA2 e SPA17 não diferiram entre os grupos. Na análise por imunocitoquímica, nenhuma diferença quanto à localização dessas proteínas nos espermatozoides foi observada. Conclusão: As proteínas do plasma seminal e dos espermatozoides refletem alterações funcionais dos espermatozoides e a infertilidade masculina.