Alterações macromoleculares da matriz extracelular em córneas com ceratocone e após crosslinking com extrato de açaí (Euterpe oleracea): um estudo ex vivo e in vitro - Peres, Murilo Bertazzo [UNIFESP] (2024)
Objetivo: Analisar os proteoglicanos e outras macromoléculas de matriz extracelular em córneas humanas normais (NL) e com ceratocone (KC), antes e após tratamento com crosslinking (CXL) e avaliar a ação e toxicidade do extrato de açaí como um potencial agente de CXL. Métodos: Córneas descartadas de banco de olhos (grupo NL) e provenientes de transplante óptico em paciente com ceratocone (grupo KC) foram obtidas para estudo. Para análise ex vivo, parte das córneas foram fixadas e preparadas para avalição da imunofluorescência em microscopia confocal. Outra parte foi submetida à extração das macromoléculas com hidrocloreto de guanidina (GuHCl) para dosagem de proteínas, identificação por eletroforese em gel de agarose, em gel de poliacrilamida com sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) e western blot, e quantificação por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Para a identificação da ação do extrato de açaí como agente indutor de CXL, foram preparados modelos experimentais de discos de colágeno feitos de gelatina, tratados com diferentes concentrações do extrato, para avaliar a resistência desses discos à digestão pela colagenase. Para análise in vitro, foram realizadas culturas primárias de ceratócitos do grupo NL e KC em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham's F-12 nutrient mixture (F-12) com soro fetal bovino 2%. Os ceratócitos foram submetidos a tratamento com extrato de açaí em diferentes concentrações (2%, 4% e 8%) e tempos de exposição (30 min , 1 h, 2 h) e, após 24 h, a viabilidade celular foi avaliada (MTT e azul tripan) e comparada com os controles e com o tratamento padrão com riboflavina 0,1% e luz ultravioleta 3 mW/cm2 por 30 min (RBUV). Macromoléculas dos ceratócitos de ambos os grupos foram avaliadas por imunofluorescência antes e após 24 h do tratamento com CXL. Resultados: Na análise ex vivo das córneas extraídas (N=8 para NL e N=12 para KC), não houve diferença em relação ao sexo, lateralidade, peso úmido, somente em relação à idade (NL – 68 anos, KC – 30 anos). No western blot, detectou-se marcação para queratam sulfato (KS), decorim e lumicam em ambos os grupos, com diferença estrutural no decorim no grupo KC, que apresentou maior peso molecular. A média da dosagem total de proteínas extraídas por peso úmido de córnea foi estatisticamente menor no grupo KC. As médias das dosagens por ELISA do decorim, lumicam e KS não apresentaram diferença entre os grupos quando normalizadas por peso úmido, mas apresentaram uma maior concentração significativa no grupo KC, quando normalizadas por μg de proteína extraída. Na imunofluorescência, observou-se distribuição semelhante dessas macromoléculas no estroma de ambos os grupos. Nos modelos experimentais de colágeno, observou-se uma maior resistência dos discos à digestão da colagenase, quanto maior foi a concentração do tratamento com extrato de açaí. No estudo in vitro de viabilidade pelo MTT (NL N=3 e KC N=2), observou-se que, em ambos os grupos, apenas houve menor viabilidade média significativa em relação ao controle no tratamento 8% por 2 h. Quando comparada a viabilidade celular por MTT (N=3 para NL e KC) para o tratamento com extrato de açaí 4% por 2 h com o tratamento padrão (RBUV), observou-se menor viabilidade média significativa em ambos os grupos no tratamento RBUV em relação ao açaí e em relação ao controle. O teste azul tripan mostrou resultados semelhantes. Na avaliação por imunofluorescências dos ceratócitos de ambos os grupos, antes e após tratamento com extrato de açaí, observou-se que os filamentos de actina do citoesqueleto aparecem com um padrão organizado em rede e mais cortical no grupo NL, e um padrão em feixe (fibras de estresse) no grupo KC, especialmente após o tratamento com extrato do açaí. Conclusões: Nas córneas com KC, ocorre diminuição de proteínas não colágenas, mas não às custas do decorim, lumicam e KS, que estão preservados, e pode haver uma maior glicosilação no decorim. O tratamento com extrato de açaí diminui a ação da colagenase em discos de colágeno, indicando capacidade de realizar CXL. In vitro, o extrato de açaí tem menor toxicidade aos ceratócitos, em comparação com o tratamento com RBUV. Os ceratócitos de córnea com ceratocone in vitro apresentam uma organização de citoesqueleto mais típica de ceratócitos ativados, principalmente após o CXL.