Caracterização funcional de um novo inibidor de cisteínopeptidases, denominado Rmcistatina-3, encontrado em hemócitos do carrapato R. microplus - Lu, Stephen [UNIFESP] (2015)
Objetivo: Caracterização funcional de um inibidor de cisteínopeptidase, denominado de Rmcistatina-3. Métodos: Inicialmente o DNA que codifica a Rmcistatina-3 foi cio nado em vetor de expressão. O inibidor recombinante foi expresso em levedura P. pastoris em seguida, a proteína recombinante foi purificada por cromatografias de troca iônica e exclusão molecular. A rRmcistatina-3 purificada foi caracterizada cineticamente frente diferentes cisteínopeptidases. Com o objetivo de entender o papel da Rmcistatina-3 na fisiologia do carrapato determinamos a localização da transcrição do inibidor por qPCR, bem como da proteína nativa por Western blot, nos diferentes tecidos do carrapato. Os ensaios de silenciamento gênico de Rmcistatina-3 foram realizados utilizando a técnica de RNA de interferência. E a análise da hemolinfa dos animais silenciados foi realizada por espectrometria de massa. Resultados:. A expressão da rRmcistatina-3 em leveduras foi de aproximadamente 35 mg/L. O inibidor recombinante purificado apresentou constantes de inibição para catepsina L (Ki = 2,48 nM ), BmCI-1 (Ki = 1,8 nM ) e catepsina B (Ki = 136 nM ). Os transcritos correspondentes a Rmcistatina-3 foram encontrados, majoritariamente, em hemócitos e em menor concentração, no corpo gorduroso e glândulas salivar, entretanto ensaios de western blot revelaram a presença da proteína nativa apenas em hemócitos e corpo gorduroso. Ensaios de infecção por bactérias gram-negativas (E. coli; revelaram uma drástica modulação negativas do mRNA da Rmcistatina-3, e carrapatos desafiados com E. coli que tiveram a Rmcistatina-3 silenciada apresentaram número menor de CFU's na hemolinfa comparado com carrapatos controle. Na tentativa de identificar o possível alvo fisiológico da Rmcistatina-3, realizamos ensaios de espectrometria de massa com a hemolinfa dos animais silenciados e não-silenciados, entretanto não foi possível identificar as proteínas diferencialmente expressas. Conclusão: Com base na localização da Rmcistatina-3 associado aos resultados obtidos por silenciamento gênico durante o desafio com bactérias gram-negativas, postulamos que a Rmcistatina-3 atua como um modulador negativo da reposta imune do carrapato R. microplus, regulando a atividade proteolítica de uma cisteínopeptidase responsável pela produção de moléculas responsáveis pelo controle de bactérias.