Comparação e validação de metodologias moleculares para diagnóstico da meningite tuberculosa - Palomo, Flavia Silva [UNIFESP] (2015)
A meningite tuberculosa é uma forma grave de tuberculose extrapulmonar e apresenta altas taxas de morbi-mortalidade. Os agentes mais comuns dessa doença são as micobactérias do complexo M. tuberculosis. O diagnóstico definitivo inclui a baciloscopia, que apresenta baixa sensibilidade e a cultura requer tempo de incubação prolongado. A utilização de métodos moleculares tem apresentado maior rapidez, sensibilidade e especificidade. Esse estudo teve como objetivo comparar e validar protocolos moleculares (PCR) para o diagnóstico da meningite tuberculosa diretamente de amostras de LCR, desde as técnicas de extração de DNA micobacteriano até o alvo para amplificação na PCR. Métodos: Para comparação e validação dos protocolos moleculares foram utilizados grupos controles positivos (amostras de LCR sabidamente negativos e contaminados com ATCC de M. tuberculosis), negativos e amostras de LCR. Quatro técnicas de extração de DNA (Fenol-Clorofórmio-Tiocianato de guanidina, Sílica-tiocianato de guanidina, Resina e Resina com etanol) foram comparadas. Além disso, o grupo controle negativo, positivo e amostras de LCR foram utilizados para determinar o melhor alvo (IS6110, hsp65KDa e MPB64) e melhor técnica (PCR convencional ou em tempo real) para diagnóstico da meningite tuberculosa. Para as análises estatísticas as amostras de LCR foram classificadas como verdadeiras positivas e negativas. Para essa classificação foi realizado um levantamento na TBweb, análise dos dados laboratoriais e prontuário dos pacientes. Resultados: O protocolo de extração que utilizou o fenol clorofórmio-tiocianato de guanidina foi o que apresentou melhores resultados quanto a quantificação e sensibilidade de amplificação pela PCR, apresentando até 10 vezes mais DNA que o segundo melhor (sílica-tiocianato de guanidina). Quanto aos alvos, não houve diferenças significativas no grupo controle positivo, já para as amostras clínicas e grupo controle negativo o IS6110 foi o que apresentou melhores resultados, tendo uma concordância boa (0,64 ?) na PCR convencional e moderada (0,54 ?) na PCR em tempo real. Os valores de sensibilidade e especificidade foram respectivamente, de 100% e 79% para a metodologia da PCR em tempo real e 94% e 87% para a PCR convencional, quando comparada à cultura. Na análise de amostra por teste o alvo IS6110 amplificado pela PCR em tempo real apresentou uma sensibilidade de 91%, especificidade de 97% e concordância ótima (0,89 ?) com o diagnóstico clínico. Quando agrupamos essa análise por paciente, observamos que esse alvo apresentou uma sensibilidade de 100%, uma especificidade de 98% e uma concordância ótima (0,96 ?) com o diagnóstico clínico. Conclusão: O protocolo utilizando a extração com uso de fenol clorofórmio e tiocianato de guanidina, seguido pela amplificação do alvo IS6110 por PCR em tempo real in house demonstrou ser adequado para o diagnóstico molecular da meningite tuberculosa em nossa casuística.