Estudo da sinalização de cálcio mediada pela enzima conversora de angiotensina I em diferentes modelos celulares - Alvarenga, Erika Lorena Fonseca Costa [UNIFESP] (2012)
Trabalhos recentes tem mostrado que a ECA (Enzima Conversora de Angiotensina I) pode tambem ser considerada uma molecula transdutora de sinal, uma vez que, tanto seu substrato endogeno BK (Fleming, 2006), quanto varios de seus inibidores sao capazes de gerar sinais intracelulares com subsequente alteracao de expressao genica de algumas proteinas. Sendo assim, estudou-se a possivel participacao do calcio na via de sinalizacao da ECA via Ang II. Com a utilizacao de Fluo-4/AM, indicador de calcio intracelular (Ca2+i), observou-se que a resposta frente a Ang I e AngII em diferentes sistemas de celulas transfectadas com vetor contendo o gene de expressao da ECA, AT1R e vetor vazio. Em celulas HEK293 transfectadas com a ECA um maior aumento de Ca2+i frente a AngII, cuja resposta foi bloqueada com a incubacao previa do inibidor da ECA, o lisinopril. Verificou-se tambem que a Ang II e capaz de se ligar a enzima com alta afinidade, mostrado em ensaios de ligacao competitiva. A hipotese dessa sinalizacao ocorrer via receptores de Ang II tipo 1 (AT1R) foi descartada, uma vez que nao foi observada a expressao do RNAm ou proteina para esse receptor nas celulas transfectadas. Realizou-se analise cinetica da mobilizacao de Ca2+ nuclear e citosolica em celulas CHO-ECA e CHO-AT1, a fim de detectar diferencas na sinalizacao de Ca2+ promovida pela AngII via ECA e AT1R. Verificou-se que a via de sinalizacao que promove aumento de Ca2+ via ECA e diferente da que promove aumento de Ca2+ via AT1R. Alem disso, verificamos que a AngII promove sinalizacao de Ca2+ nuclear via AT1R, diferentemente da sinalizacao de Ca2+ promovida pela ECA.Para verificar a participacao do IP3 citosolico na mobilizacao de Ca2+ induzida por AngII, utilizou-se o adenovirus IP3Sponge-NES-DsRed que expressa um vetor de expressao que tampona o IP3 citosolico. Os resultados sugerem que a via de sinalizacao da ECA e primeiramente mediada por IP3 citosolico e que a sinalizacao de Ca2+ via AT1R pela AngII nao e exclusivamente citosolica, mas tambem ocorre no nucleo celular. Funcionalmente a importancia desta nova via de sinalizacao da ECA foi observada em celulas de melanoma, verificando maior liberacao de anion superoxido na presenca de AngII, a qual e inibida na presenca de lisinopril e losartan. Em resumo, nossos resultados mostram pela primeira vez que a AngII liga-se a ECA com alta afinidade e consequentemente promove formacao de IP3 via ativacao da PLCβ3. Verificou-se tambem que a ECA e capaz de internalizar AngII mais rapidamente que o AT1R. Esse estudo evidencia um novo aspecto da biologia da ECA e abre novas perspectivas de estudo, em relacao a importancia fisiopatologica desta sinalizacao