AGK::BRAF no carcinoma papilífero da tiroide pediátrico: investigação do mecanismo associado à agressividade tumoral e análise funcional - Sisdelli, Luiza de Mello Oliveira [UNIFESP] (2023)
Introdução: O carcinoma papilífero da tireoide (CPT), apesar de ser raro em crianças e adolescentes, geralmente têm uma apresentação clínica mais agressiva nesta população do que o CPT em adultos, apresentando multifocalidade, subtipos histológicos mais agressivos, presença de invasão tumoral, e maior prevalência de metástase loco-regional e à distância. Apesar disso, a mortalidade pelo câncer na faixa etária pediátrica é inferior àquela reportada em adultos. Tem sido sugerido que estas características clínico patológicas observadas em pacientes pediátricos (≤ 18 anos) deve-se, principalmente, às diferenças observadas quanto ao tipo de alteração observada nos genes “drivers” que levam à ativação constitutiva da via MAPK/ERK neste grupo de pacientes, bem como, maior responsividade ao tratamento convencional como iodo. Objetivos: Esta tese teve como objetivo analisar alterações genéticas associadas a ativação das vias RAS/MAPK/ERK e PI3K/AKT em 79 casos de CPT pediátricos e avaliar o efeito da presença da fusão AGK::BRAF na ativação da via MAPK, na expressão do gene NIS (do inglês, sodium/iodide symporter) e na atividade de NIS, bem como, em processos biológicos associados à progressão tumoral. Metodologia: As fusões gênicas (RET::PTC1, RET::PTC3, AGK::BRAF, ETV6::NTRK3 e STRN::ALK) foram avaliadas por RT-PCR e as variantes patogênicas do tipo SNVs (do inglês, Single Nucleotide Variants) (BRAF V600E, e TERT C228T/C250T) avaliadas por sequenciamento de Sanger. A análise funcional foi realizada na linhagem celular derivada de células foliculares de tiroide normal de rato (PCCL3) permanentemente e independentemente transfectadas com plasmídeo contendo cDNA de AGK::BRAF, ETV6::NTRK3, RET::PTC1, RET::PTC3, BRAF V600E, e BRAF WT (do inglês, wild type). Para examinar o efeito destes eventos genéticos nas vias de sinalização RAS/MAPK/ERK e PIK3/AKT e nas taxas da expressão de NIS, utilizamos a técnica de Western-blot. A atividade de NIS foi analisada por um ensaio de captação de iodeto não radioativo. A instabilidade genômica foi investigada por ensaio de micronúcleos com DAPI e microscopia fluorescente. A organização dos telômeros foi avaliada por hibridização in situ fluorescente quantitativa (Q-FISH) seguida por análise da organização tridimensional (3D) dos telômeros utilizando o software TeloView®. A organização da cromatina, por microscopia de super-resolução de iluminação estruturada tridimensional (3D-SIM), seguido por granulometria. Resultados: Na análise do perfil molecular, identificamos alterações genéticas em 53/79 (67%) dos casos de CPT, sendo que 59% (47/79) apresentavam fusões gênicas. RET::PTC1 foi a alteração genética mais frequente (22/79, 28%), seguida de AGK::BRAF (15/79, 19%), ETV6::NTRK3 (14/79, 18%), RET::PTC3 (12/79, 15%), BRAF V600E (11/79, 14%) e STRN::ALK (3/79, 4%). Entre as amostras analisadas para mutações do promotor de TERT (C228T e C250T) (n = 42), apenas uma (1/42, 2,4%) carregava uma variante patogênica (C250T). Além disso, identificamos a coexistência de mais de uma alteração genética associada à via MAPK em cerca de 1/3 desta coorte. Encontramos uma associação entre a presença de fusão RET::PTC3 e metástases linfonodais, multifocalidade e tamanho do tumor. A análise funcional demonstrou que a fusão AGK::BRAF leva a maior ativação da via MAPK e menor expressão e atividade de NIS em células PCCL3. Estes dados foram acompanhados por um maior número de micronúcleos e pontes anafásicas, alteração da organização 3D dos telômeros e da estrutura da cromatina. Demonstramos que os tumores de pacientes pediátricos têm diferentes assinaturas de organização telomérica e estrutura do DNA, em comparação com o tecido normal, sugerindo uma ruptura progressiva da organização da cromatina e dos telômeros, que pode estar relacionada à instabilidade genômica. Além disso, dados preliminares do 3D-SIM demonstram que pacientes com características clinicopatológicas de mau prognóstico (metástase à distância, multifocalidade e tamanho tumoral > 2 cm) apresentam mais espaços pobres em DNA nos núcleos dos tumores. Curiosamente, os tumores positivos para a fusão AGK::BRAF, mostraram uma tendência a ter mais espaços pobres em DNA em seus núcleos. De fato, demonstramos, em uma análise feita em um relato de caso, que a fusão AGK::BRAF resulta em uma organização diferente dos telômeros e do DNA, quando comparada a RET::PTC3. Conclusão: Aqui confirmamos que rearranjos são o evento genético mais comum no CPT pediátrico, e ainda demonstramos que co-ocorrência de mais de uma alteração genética que levam à ativação da via RAS/MAPK/ERK são prevalentes nos tumores desta população. Importante, observamos que o rearranjo RET::PTC3 está associado a características de mau prognóstico no CPT pediátrico. Os dados da análise funcional ajudaram a elucidar os mecanismos pelos quais a fusão AGK::BRAF causa a desdiferenciação das células tiroidianas e um comportamento mais agressivo das células tumorais em casos pediátricos de CPT com metástase à distância. Também demonstramos como o estudo da organização tridimensional nuclear e da estrutura do DNA do CPT pediátrico pode ser de extrema importância para o melhor entendimento desses tumores.