Otimização molecular e metabólica de Leishmania tarentolae para produção de glicoproteínas de interesse biotecnológico
Ano de defesa: | 2022 |
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Universidade Federal de Viçosa
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Bioquímica Aplicada
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Resumo: | A produção de glicoproteínas terapêuticas possui alto custo devido a necessidade de utilização de cultura de células de mamíferos que dependem de meios de cultivo complexos e caros e possuem baixo rendimento de produção. Leishmania tarentolae, um protozoário tripanossomátideo não patogênico para mamíferos, tem sido sugerido como um sistema alternativo para expressão heteróloga de glicoproteínas devido a existência de métodos eficientes de expressão heteróloga, ser facilmente adaptado para produção em alta escala e depender de meios de cultura de baixo custo. Além disso, este protozoário apresenta modificações pós- traducionais ausentes em bactérias e leveduras, organismos mais utilizados para produção industrial de proteínas recombinantes. O Interferon-β, é uma proteína utilizada em tratamentos de doenças como esclerose múltipla, as suas glicosilações são extremamente relevantes para suas funções biológicas. Embora o perfil de glicosilação de proteínas expressas em L. tarentolae seja semelhante a mamíferos, existem algumas diferenças no perfil de carboidratos presentes nas terminações das cadeias glicídicas devido à ausência de enzimas de biossínteses e incorporação de ácido siálico. Nesta tese foi desenvolvido e otimizado uma plataforma de expressão de glicoproteínas utilizando linhagens de L. tarentolae geneticamente otimizadas para síntese de glicoproteínas em alta escala mais estáveis com incorporação de ácido siálico na extremidade da cadeia glicídica e sua aplicação na produção de Interferon-β humano. Além da validação da produção do Interferon-β, também foi realizado caracterização de seus glicanos e validação de sua atividade para regulação de inflamação em modelo murinho, demonstrando que esta nova linhagem geneticamente otimizada de L. tarentolae é adequada para produção em larga escala de glicoproteínas terapêuticas. Palavras-chave: Leishmania tarentolae. Interferon-β. Proteínas terapêuticas. Glicosilação |
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Senra, Renato Limahttp://lattes.cnpq.br/1786546008789832Mendes, Tiago Antônio de Oliveira2022-08-11T13:18:05Z2022-08-11T13:18:05Z2022-02-24SENRA, Renato Lima. Otimização molecular e metabólica de Leishmania tarentolae para produção de glicoproteínas de interesse biotecnológico. 2022. 193 f. Tese (Doutorado em Bioquímica Aplicada) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2022.https://locus.ufv.br//handle/123456789/29615https://doi.org/10.47328/ufvbbt.2022.302A produção de glicoproteínas terapêuticas possui alto custo devido a necessidade de utilização de cultura de células de mamíferos que dependem de meios de cultivo complexos e caros e possuem baixo rendimento de produção. Leishmania tarentolae, um protozoário tripanossomátideo não patogênico para mamíferos, tem sido sugerido como um sistema alternativo para expressão heteróloga de glicoproteínas devido a existência de métodos eficientes de expressão heteróloga, ser facilmente adaptado para produção em alta escala e depender de meios de cultura de baixo custo. Além disso, este protozoário apresenta modificações pós- traducionais ausentes em bactérias e leveduras, organismos mais utilizados para produção industrial de proteínas recombinantes. O Interferon-β, é uma proteína utilizada em tratamentos de doenças como esclerose múltipla, as suas glicosilações são extremamente relevantes para suas funções biológicas. Embora o perfil de glicosilação de proteínas expressas em L. tarentolae seja semelhante a mamíferos, existem algumas diferenças no perfil de carboidratos presentes nas terminações das cadeias glicídicas devido à ausência de enzimas de biossínteses e incorporação de ácido siálico. Nesta tese foi desenvolvido e otimizado uma plataforma de expressão de glicoproteínas utilizando linhagens de L. tarentolae geneticamente otimizadas para síntese de glicoproteínas em alta escala mais estáveis com incorporação de ácido siálico na extremidade da cadeia glicídica e sua aplicação na produção de Interferon-β humano. Além da validação da produção do Interferon-β, também foi realizado caracterização de seus glicanos e validação de sua atividade para regulação de inflamação em modelo murinho, demonstrando que esta nova linhagem geneticamente otimizada de L. tarentolae é adequada para produção em larga escala de glicoproteínas terapêuticas. Palavras-chave: Leishmania tarentolae. Interferon-β. Proteínas terapêuticas. GlicosilaçãoThe production of therapeutic glycoproteins is expensive due to the need to use mammalian cell cultures that depend on complex and expensive culture media and have low yield of production. Leishmania tarentolae, a non-pathogenic mammalian trypanosomatid protozoan, has been suggested as an alternative system for heterologous expression of glycoproteins due to the existence of efficient methods of heterologous expression, it is easily adapted for high-scale production and depending on low-cost culture media. In addition, this protozoan presents post- translational modifications absent in bacteria and yeasts, organisms most used for industrial production of recombinant proteins. Interferon-β is a protein used in the treatment of diseases such as multiple sclerosis, its glycosylations are extremely relevant to its biological functions. Although the glycosylation profile of proteins expressed in L. tarentolae is similar to mammals, there are some differences in the profile of carbohydrates present at the ends of the sugar chains due to the absence of biosynthesis enzymes and sialic acid incorporation. Here, we developed and optimized a platform using genetically optimized L. tarentolae strains for the synthesis of more stable high-scale glycoproteins with sialic acid incorporation at the end of the sugar chain and its application in the production of human Interferon-β. In addition to validating the production of Interferon-β, characterization of its glycans and validation of its activity for regulating inflammation in a murine model was also performed, demonstrating that this new genetically optimized strain of L. tarentolae is suitable for large-scale production of glycoproteins therapeutics. Keywords: Leishmania tarentolae. Interferon-β. Therapeutic proteins. Glycosylation.porUniversidade Federal de ViçosaBioquímica AplicadaGlicosilaçãoInterferon-βGlicoproteínasLeishmania tarentolaeBiologia MolecularOtimização molecular e metabólica de Leishmania tarentolae para produção de glicoproteínas de interesse biotecnológicoMolecular and metabolic optimization of Leishmania tarentolae for glycoproteins production of biotechnological interestinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisUniversidade Federal de ViçosaDepartamento de Bioquímica e Biologia MolecularDoutor em Bioquímica AplicadaViçosa - MG2022-02-24Doutoradoinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:LOCUS Repositório Institucional da UFVinstname:Universidade Federal de Viçosa (UFV)instacron:UFVORIGINALtexto completo.pdftexto completo.pdftexto completoapplication/pdf53249769https://locus.ufv.br//bitstream/123456789/29615/1/texto%20completo.pdf153fa199464f8b7d8b41e355c3925a40MD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81748https://locus.ufv.br//bitstream/123456789/29615/2/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD52123456789/296152022-09-01 14:12:16.187oai:locus.ufv.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.locus.ufv.br/oai/requestfabiojreis@ufv.bropendoar:21452022-09-01T17:12:16LOCUS Repositório Institucional da UFV - Universidade Federal de Viçosa (UFV)false |
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