Purificação parcial e caracterização cinética da inibição de proteases intestinais tripsina-like de Anticarsia gemmatalis

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Vargas, Adriana Maria Patarroyo
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Mestrado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Protease; Tripsina-like; Anticarsia gemmatalis; Trypsin-like; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::ENZIMOLOGIA
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2432

A Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), conhecida como lagarta da soja, é considerada a principal praga desta cultura, causando enormes prejuízos devido ao ataque herbívoro. Por causa da importância das proteases digestivas na fisiologia das larvas, o estudo de inibidores de proteases como agentes de controle de pragas tem recebido atenção contínua. A redução da atividade proteolítica através da ingestão de inibidores de proteases compromete a digestão e reflete em efeitos não apenas no crescimento e no desenvolvimento das larvas, mas também na fertilidade e fecundidade do adulto. Para utilizar a estratégia de controle via inibição das enzimas digestivas é necessário o esclarecimento sob o ponto de vista estrutura/função dessas macromoléculas. Uma forma de abordar esse aspecto implica no conhecimento sobre a cinética enzimática, assim como a caracterização da cinética de inibição destas proteases, o que permite uma melhor compreensão dos centros ativos e dos mecanismos de ação da enzima. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo estudar a cinética de inibição das serino-proteases intestinais de A. gemmatalis utilizando diferentes inibidores de proteases sintéticos e protéicos para identificar um potente inibidor a ser utilizado no processo de defesa de plantas de soja a A. gemmatalis. Para isso, um extrato solúvel do intestino de larvas de A. gemmatalis foi submetido à cromatografia em coluna de afinidade p-aminobenzamidina agarose e a fração eluída foi submetida à eletroforese. Foram observadas a presença de duas bandas com massas moleculares aproximadas de 35kDa e 66kDa. Na caracterização cinética o valor de KM para o substrato L-BApNA foi de 0,503mM, Vmáx foi 46,650nM.s-1, Vmáx/[E] foi 9,256nM.s-1.mg-1.L e Vmáx/[E]/KM foi de 18,402nM. s-1.mg-1.L. mM-1. No estudo de inibição os inibidores benzamidina, berenil, SKTI e SBBI obtiveram Ki de 11,2μM, 32,4μM, 0,25nM e 1,4nM, respectivamente, todos calculados pelo método de Dixon. Para caracterizar o tipo de inibição foi utilizado o gráfico do duplo recíproco de Lineweaver-Burk e o gráfico das inclinações de Lineweaver-Burk versus a concentração do inibidor. Para os quatro inibidores testados a inibição foi caracterizada como competitiva linear na faixa de concentração utilizada. Os valores de Ki determinados mostraram que o inibidor SKTI foi o que melhor inibiu a atividade tripsina-like das serino-proteases purificadas do intestino médio de A. gemmatalis tornando-se um alvo promissor de estudo para a produção de inibidores peptídeo miméticos.