Propriedades bioquímicas e cinético-enzimáticas de serino e cisteíno proteases produzidas por bactérias isoladas do trato intestinal de Anticarsia gemmatalis

• Ano de defesa: 2008
• Autor(a) principal: Pilon, Franciny Martins
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Mestrado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Anticarsia gemmatalis; Bactérias; Serino; Cisteíno; Bacteria; Serine; Cysteine; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::ENZIMOLOGIA
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2396

Inibidores de proteases atuam no mecanismo de defesa de plantas contra infestação de insetos e patógenos. A utilização de genes que codificam inibidores de enzimas digestivas para a obtenção de plantas resistentes ao ataque de insetos é uma estratégia promissora. Porém, para que isso ocorra é importante que a planta expresse uma combinação de inibidores que cubra o espectro total de proteases intestinais. Dessa forma, deve ser considerada a fisiologia do inseto, a bioquímica de sua digestão e a microbiota local. Recentemente foram isoladas diversas bactérias proteolíticas do intestino da lagarta-da-soja, Anticarsia gemmatalis. Todas foram capazes de produzir quantidades significativas de proteases quando cultivadas em meio de cultura adequado. Neste contexto o presente trabalho fundamentou-se em caracterizar as serino e cisteíno proteases provenientes de Bacillus cereus, Staphylococcus xylosus, Enterococcus mundtii e Enterococcus gallinarum, isoladas do trato intestinal de A. gemmatalis. As culturas bacterianas foram inoculadas em meio de cultura infusão cerébro coração(BHI) acrescidos de 0,1% de soro albumina bovina (BSA) mantidas a 37°C, a 200 rpm em agitador. Os extratos enzimáticos foram obtidos através de centrifugação das culturas a 10.000 rpm por 20 minutos a 4°C. Todas as serino e cisteíno proteases foram capazes de hidrolisar a caseína, e os substratos sintéticos L- BApNA e L-TAME. Verificou-se pronunciada atividade das serino proteases em pH 8,5 para B. cereus, S. xylosus, E. gallinarum, e em pH 7,5 para E. mundtii e temperaturas de maior atividade a 250C para B. cereus, a 300C para S.xylosus e E. mundtii e 350C para E.gallinarum sobre os substratos L- BApNA e L-TAME. Para as cisteíno proteases de todas as bactérias verificou-se maior atividade em pH 7,5 frente os substratos L-BApNA e L-TAME. O efeito da temperatura para as cisteíno proteases bacterianas sobre os substratos LBApNA e L-TAME mostraram maior atividade a 35ºC para B. cereus e S. xylosus, 25ºC para E. mundtii e 300C para E. gallinarum. Os valores de KMapp para serino proteases utilizando L-BApNA foram de 0,15 mM, 0,12 mM, 0,14 mM, e 0,26 mM respectivamente, para B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum. Os valores de KMapp determinados nos ensaios com o substrato L-TAME foram de 12,4 µM, 48,4 µM, 18,2 µM e 45,2 µM, respectivamente, para B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum. Para cisteíno proteases utilizando L- BApNA os valores de KMapp obtidos foram de 0,67 mM, 0,63 mM, 0,67 mM, e 0,270 mM, respectivamente para B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum, e com substrato L- TAME foram de 0,11 mM, 0,13 mM, 0,12 mM e 0,16 mM respectivamente, para B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum. Na análise do efeito de íons cálcio na atividade proteolítica frente os LBApNA e L-TAME, observou-se que as atividades das serino e cisteíno proteases presentes nos extratos bacterianos aumentaram em presença de CaCl2. O efeito de vários inibidores de proteases também foi avaliado, usando L-BApNA e L-TAME como substratos. Com relação ao efeito da concentração de EDTA, inibidor de metalo proteases e quelante de íons Ca+2, verificou-se uma diminuição na atividade amidásica e esterásica com o aumento da concentração de EDTA na mistura de reação para as serino e cisteíno proteases bacterianas. Os inibidores de serino proteases TLCK (irreversível) e Aprotinina (competitivo) diminuíram significativamente a atividade das serino proteases bacterianas. O inibidor de cisteíno proteases E-64 não influenciou as serino proteases bacterinas, o contrário foi observado para as cisteíno proteases produzidas pelas bactérias, onde ocorreu queda na atividade amidásica e esterásica frente o inibidor E-64. Um aumento de TLCK no meio fez com que a atividade das cisteíno proteases bacterianas diminuísse gradativamente, fato atribuído à reação desse inibidor com resíduo de aminoácido histidina na tríade catalítica de cisteíno proteases. A Aprotinina, não influenciou as cisteíno proteases bacterianas. Pespstatina A, inibidor de aspartil proteases não influenciou as serino nem as cisteíno proteases bacterianas. Assim, os resultados de caracterização cinética e de efeito de inibidores de proteases sobre a atividade das proteases produzidas por B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum concluem que essas bactérias sintetizam e excretam no lúmen intestinal de A. gemmatalis, enzimas da família das serino e cisteíno proteases.