Identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com a proteína NSP do geminivirus - Mariano, Andréa Cristina (2002)
A família Geminiviridae é uma família de vírus de planta constituída por vírus compostos por genoma circular de DNA fita simples que utilizam fatores do hospedeiro tanto para sua replicação quanto para a translocação do genoma viral no hospedeiro. Com a finalidade de identificar fatores do tomateiro que interagem com as proteínas virais do geminivírus TGMV (Tomato golden mosaic virus), foi utilizado o sistema duplo híbrido para escrutínio de proteínas positivas quanto à interação. As regiões codificadoras das proteínas MP, NSP e REn foram amplificadas e inseridas, individualmente, no vetor pBDGAL4 Cam, fusionadas ao domínio de ligação ao DNA do gene GAL4. Paralelamente foi construída uma biblioteca de cDNA de tomateiro, propagada em vetor de S. cerevisae derivados de lambda ZAPII. O escrutínio da biblioteca de cDNA assim como os ensaios funcionais de identificação de interação entre proteínas geminivirais foram conduzidos no sistema duplo-híbrido de leveduras. Ao contrário das proteínas MP e NSP, a proteína viral REn apresentou a capacidade de ativar a transcrição quando fusionada ao domínio de ligação ao DNA, o que impossibilitou seu uso como isca em ensaios de interação proteína-proteína por esse sistema. A expressão correta das proteínas de movimento MP e NSP, direcionada pelos vetores do sistema duplo-híbrido, foi comprovada pela capacidade das proteínas recombinantes em interagirem ativando os genes repórteres. A interação entre MP e NSP, identificada no presente trabalho, está coerente com os modelos propostos para movimento de geminivírus no hospedeiro, os quais sugerem a interação entre essas duas proteínas durante o processo de translocação do genoma viral. A proteína NSP foi então utilizada como isca nos ensaios de interação proteína-proteína, utilizando como alvo as proteínas codificadas pela biblioteca de cDNA de tomateiro. Como resultado do escrutínio da biblioteca de cDNA de tomateiro, foram identificados cinco cDNAs que codificam proteínas capazes de interagir com NSP com diferentes intensidades, conforme demonstrado em ensaios quantitativos da atividade do gene repórter β-galactosidase. A análise de seqüência e do padrão de restrição desses clones demonstraram que quatro deles eram idênticos e codificavam um domínio conservado de quinase serina/treonina, sendo denominado NIK (NSP - Interacting Kinase). Evidências indicam que, provavelmente, a interação entre NIK e NSP seja funcional. Análise da estrutura primária de NSP demonstrou a presença de resíduos de serina e treonina em contexto favorável para fosforilação. Além disso, NIK não foi capaz de interagir com outras proteínas virais e com controles, pelo sistema duplo híbrido, confirmando a especificidade da interação NSP-NIK. A análise comparativa da seqüência parcial do cDNA de NIK com seqüências de cDNAs de uma biblioteca de semente de soja mostrou que a proteina NIK possui cerca de 92% de similaridade de seqüência, na região carboxiterminal, com uma proteína quinase de soja. A quinase identificada em soja, denominada GmNIK (Glicine max NIK), contém 623 resíduos de aminoácidos e uma massa molecular estimada em 68586,10 kDa e foi capaz de interagir com NSP por meio do sistema duplo híbrido. GmNIK possui, além do domínio de quinase um domínio de ligação a ATP 309 419 IIHRDVKAANILL 431 , LGKGFGNVYKKGVFPDGTLVAVKK 332 , uma hélice transmembrana, provavelmente responsável pela inserção da proteína na 96 membrana plasmática, e regiões ricas em leucina, LTNQIVLLQNNNISGPIPSELGKLKLTQLDLSNNFFSGGIPPSLGHL 167 como 144 e 192 MTQLNFLDLSYNNLSGPVPRILAKS . Os domínios encontrados em GmNIK são característicos de proteínas codificadas por genes de resistência e de receptores de membrana envolvidos em programas de desenvolvimento. A predição do modelo topológico de GmNIK baseado em sua estrutura modular, similar `aquela da proteína codificada pelo gene de resistência Xa21, sugere a posição intracelular do domínio de quinase e do domínio de ligação a nucleotídeo, enquanto que as regiões ricas em leucina são voltadas para o meio extracelular. A posição intracelular do domínio de quinase está coerente com a hipótese de interação funcional entre GmNIK e NSP, uma vez que NSP localiza- se no meio celular interno. Ensaios adicionais deverão ser conduzidos para confirmar se a proteína viral NSP é fosforilada por NIK in vitro e in vivo.