Papel das enzimas oxidativas na deterioração fisiológica de mandioca - Ramos, Paula Acácia Silva (2011)
A alta perecibilidade das raízes de mandioca (Manihot esculenta, Crantz) in natura faz com que as mesmas tenham que ser consumidas dentro de um período muito curto após a colheita. A principal causa deve-se a deterioração fisiológica, caracterizada por estrias azuladas e pigmentos escuros na polpa que progride ao longo dos parênquimas, atribuído a reações das enzimas peroxidase E.C. 1.11.1.7. (POD) e Polifenoloxidase E.C. 1.10.3.1. (PPO). Este trabalho foi realizado com objetivos de purificar parcialmente e caracterizar cineticamente essas enzimas, avaliando condições ótimas de suas atividades, e verificar o efeito de diferentes inibidores da atividade da POD como tratamento pós-colheita, visando reduzir o escurecimento enzimático. As raízes utilizadas para purificação cinética foram cortadas para induzir a atividade da POD e PPO. A cinética da atividade foi determinada em condições de pHs variando de 2,5 a 9,0 em condições de ambiente (25 ºC) e gelo (4 ºC), e diferentes temperaturas. A POD e PPO extraídas de raízes de mandioca foram parcialmente purificadas por fracionamento em sulfato de amônio de 0 a 80% e diálise, com intervalos de 20%. Foram testados diferentes substratos da PPO: ácido caféico, ácido clorogênico, ácido p-cumárico, catecol, 4-metil-catecol, DLdopa, pirogalol à concentração de 15 mM. Para avaliar diferentes inibidores da POD, raízes inteiras e isentas de danos foram tratadas por uma hora em soluções contendo produtos como o ácido ascórbico, azida sódica, bissulfito de sódio, Na2EDTA, L-cisteína e SDS nas concentrações de 1, 5 e 10 mM, e deixadas à temperatura ambiente por seis dias. A cada dois dias foi realizada análise visual e retiradas amostras de 2 cm de espessura para avaliar a atividade enzimática. A otimização do ensaio enzimático para a POD e PPO de raízes de mandioca in natura foi conseguida quando os extratos foram saturados de 60-80% e a reação processou-se em pHs 6,0 e 6,5, em temperaturas de 40 ºC e 30 ºC, respectivamente, sendo o substrato de maior afinidade com a PPO o ácido clorogênico. A inativação completa da POD e PPO ocorreram em pH 2,5 a temperatura ambiente (25 ºC) após 60 minutos e 30 minutos respectivamente. Em pH 9,0 não houve inativação total da atividade das enzimas POD e PPO. Portanto, a atividade da peroxidase não foi inativada em pH alcalino, sendo menos estável em pH ácido, que mostrou ser efetivo na redução da atividade enzimática, causando danos rápidos ao sítio ativo. Nos extratos da POD pré-incubados a 50 ºC e 60 ºC tiveram redução na atividade de 30,7% aos 70 minutos, e 40,7% aos 60 minutos sem inativação total. Em temperaturas mais elevadas (70 e 80 ºC) não foi constatada inativação total da atividade. Nos extratos pré-incubados da polifenoloxidase a 50 ºC, 60 ºC e 70 ºC durante o período de 10 min resultaram em inativação parcial de 60%, 77% e 81,7%, respectivamente, sem inativação total por mais tempo de préincubação (180 minutos). Houve inativação total com 80 ºC aos 50 minutos. Houve relação entre atividade da peroxidase e o escurecimento, todos tratamentos foram eficientes em aumentar a vida de prateleira das raízes de mandioca in natura em até 4 dias. No segundo dia houve 100% de raízes sem escurecimento, em relação ao controle, nas três concentrações. O pH ácido mostrou ser mais eficiente em reduzir a atividade enzimática da POD e PPO, mostrando que o tratamento com pré-incubação em pHs ácidos são eficazes em reduzir a atividade destas enzimas. E tratamentos com temperaturas de 80 ºC por um período superior a 50 minutos, também mostrou ser eficiente em reduzir a atividade enzimática da PPO. Foi possível aumentar a vida de prateleira de raízes de mandioca tratadas com ácido ascórbico, bissulfito de sódio e L-cisteína. O escurecimento das raízes de mandioca in natura foi reduzido, aplicando-se diferentes inibidores nas concentrações de 1mM, 5 mM ou 10mM.