Desenvolvimento de reação isotérmica do tipo LAMP usando genômica comparativa para a detecção do patógeno bacteriano Erwinia psidii

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2024
Autor(a) principal: Carvalho, Alice Maria Silva de
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: eng
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Goiaba - doenças e pragas
Eucalipto - doenças e pragas
Diagnóstico
Link de acesso: http://repositorio.unb.br/handle/10482/50889
Resumo: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2024.
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spelling Desenvolvimento de reação isotérmica do tipo LAMP usando genômica comparativa para a detecção do patógeno bacteriano Erwinia psidiiDevelopment of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reaction using comparative genomics for the detection of the bacterial pathogen Erwinia psidiiGoiaba - doenças e pragasEucalipto - doenças e pragasDiagnósticoDissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2024.A seca dos ponteiros, doença bacteriana causada por Erwinia psidii, é considerada uma importante doença da cultura da goiabeira (Psidium guajava L.) e do eucalipto (Eucalyptus spp.), chegando a causar entre 30 e 85% de perdas, é um dos principais fatores limitantes da produção. Uma vez que a principal forma de disseminação da doença é através de material vegetal propagativo assintomático, métodos sensíveis, rápidos e acurados para a detecção do patógeno em plantas assintomáticas são necessários para a diagnose precoce. Assim, o objetivo deste trabalho consiste no desenvolvimento de um ensaio de detecção molecular de amplificação isotérmica (LAMP) para detecção de Erwinia psidii na cultura da goiaba e do eucalipto. Em busca de regiões genômicas exclusivas para E. psidii, foi realizada a análise de genômica comparativa com o software RUCS, comparando as sequências do alvo juntamente com as regiões de diversos agentes fitopatogênicos que acometem as culturas da goiaba e do eucalipto. Das 842 regiões exclusivas, somente as cinco com maior potencial foram usadas para o desenho de conjuntos de primers. Além dessas, a região recA, anteriormente usada para o desenvolvimento de primers específicos para PCR convencional e qPCR, também foi selecionada. Os sete conjuntos de primers foram desenhados na plataforma NEB® LAMP Primer Design Tool. A verificação de compatibilidade dos primers foi realizada utilizando o isolado tipo IBSBF435, onde foram avaliadas duas temperaturas (60 e 65 ºC) e seis intervalos de tempo (30, 40, 50, 55, 60 e 75 minutos). A temperatura de 65 ºC, com mudança de cor para quatro dos sete conjuntos, a partir de 50 minutos. Em seguida, foi realizado um ensaio para examinar a proporção entre primers internos e externos para aprimorar o LAMP. A proporção 8:1 (mais diluído) foi capaz de resultar em amplificação três dos quatro conjuntos, enquanto na concentração de 4:1, todos os quatro conjuntos foram capazes de amplificação. A sensibilidade do conjunto de primers mais promissor (Ep19) foi testada com seis diluições do DNA extraído do isolado tipo, entre 10 e 1x10-5 ng.µL-1 . O ensaio alcançou a sensibilidade para detectar até 1x10-4 ng.µL-1 . O ensaio LAMP desenvolvido neste estudo demonstrou ser um método rápido e eficaz para a detecção de Erwinia psidii em laboratório, além de detectar o DNA de E. psidii em baixas concentrações, demonstrando uma alta sensibilidade.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The bacterial disease known as "dieback" or “wilt dieback”, caused by Erwinia psidii, is considered a significant threat to both guava (Psidium guajava L.) and eucalyptus (Eucalyptus spp.) crops, causing losses ranging from 30 to 85%. It is one of the main limiting factors in production. Since the primary mode of disease transmission is through asymptomatic propagative plant material, sensitive, rapid, and accurate methods for detecting the pathogen in asymptomatic plants are necessary for early diagnosis. Therefore, the objective of this study is to develop a molecular detection assay using Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for the detection of Erwinia psidii in guava and eucalyptus crops. Comparative genomic analysis using the RUCS software was conducted to identify unique genomic regions specific to E. psidii, comparing target sequences with regions of various phytopathogenic agents affecting guava and eucalyptus crops. Among the 842 unique regions identified, only the top five with the highest potential were used for primer set design. Additionally, the recA region, previously used for developing specific primers for conventional PCR and qPCR, was also selected. Seven primer sets were designed using the NEB® LAMP Primer Design Tool. Primer compatibility verification was performed using the IBSBF435 isolate, evaluating two temperatures (60 and 65 ºC) and six time intervals (30, 40, 50, 55, 60, and 75 minutes). At 65 ºC, color change occurred for four out of the seven primer sets after 50 minutes. Subsequently, an assay was conducted to examine the ratio between internal and external primers to optimize LAMP. The ratio of 8:1 (more diluted) resulted in amplification of three out of the four primer sets, while at a ratio of 4:1, all four primer sets were able to amplify. The sensitivity of the most promising primer set (Ep19) was tested with seven dilutions of DNA extracted from the isolate, ranging from 10 to 1x10-5 ng.µL-1 . The assay achieved sensitivity to detect up to 1x10-4 ng.µL1 . O ensaio alcançou a sensibilidade para detectar até 1x10-4 ng.µL-1 . The LAMP assay developed in this study has proven to be a rapid and effective method for detecting Erwinia psidii in the laboratory, as well as detecting E. psidii DNA at low concentrations, demonstrating high sensitivity.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Fitopatologia (IB FIT)Programa de Pós-Graduação em FitopatologiaRossato, MaurícioCarvalho, Alice Maria Silva de2024-11-13T17:11:35Z2024-11-13T17:11:35Z2024-11-132024-05-09info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfCARVALHO, Alice Maria Silva de. Desenvolvimento de reação isotérmica do tipo LAMP usando genômica comparativa para a detecção do patógeno bacteriano Erwinia psidii. 2024. 68 f., il. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia) — Universidade de Brasília, Brasília, 2024.http://repositorio.unb.br/handle/10482/50889engA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-11-13T17:11:35Zoai:repositorio.unb.br:10482/50889Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-11-13T17:11:35Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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