Caracterização fitoquímica e neurofarmacológica de compostos inseticidas isolados de Prasiola crispa (Lightfoot) Kützing (1843) - Lorensi , Graziela Holkem (2015)
Organismos adaptados a ambientes extremos como a Antártica tendem a apresentar uma constituição única em termos de metabólitos secundários. Desta forma, estudos que visem à elucidação de efeitos biológicos de organismos vegetais oriundos destas regiões são relevantes do ponto de vista biotecnológico. Este trabalho investigou o mecanismo envolvido na atividade inseticida do extrato bruto da Prasiola crispa uma alga oriunda de áreas de degelo da Antártica, em modelos neurofisiológicos de baratas da espécie Nauphoeta cinerea. Também foi investigado o mecanismo de ação dos compostos bioativos oriundos do material vegetal, relacionado a essa atividade. A alga foi coletada, próxima à região da estação Polonesa Arctowski, na Baia do Almirantado. O mecanismo de toxicidade do extrato hexânico da alga Prasiola crispa foi demonstrado inicialmente através de avaliações toxicológicas em ensaios de letalidade para a determinação da DL50. Foram realizados ensaios bioquímicos para determinação da atividade da enzima AChE sobre o homogeinizado de cérebro de baratas. Também foram usados modelos biológicos in situ e in vivo com o intuito de se verificar a atividade do extrato sobre diferentes sistemas fisiológicos desses animais como o sistema cardiovascular, sistema nervoso periférico e o sistema nervoso central. Nesse sentido, usando à técnica do coração semi-isolado de baratas in situ, a de músculo coxal abdutor-metatoráxico in vivo e a técnica para a medida da atividade de grooming in vivo. O extrato hexânico de Prasiola crispa (HPC) foi preparado de acordo com a técnica fitoquímica convencional. A análise fitoquímica preliminar foi feita usando-se a cromatografia de camada delgada (CCD). Assim, os ensaios para a determinação da dose letal mínima (DL50) nas concentrações 100, 200, 400 e 800µg/g de animal, demonstraram que a dose de 400μg/g ocasionou a morte de 50% dos animais, sendo esta considerada a DL50 para Nauphoeta cinerea, 24h após a administração do composto (n=10 em triplicata *p≤0,05). Os ensaios para a medida da atividade da AChE, demonstraram que o HPC 100, 200, 400 e 800µg/g de animal, não inibe significativamente essa enzima (p≥0.05, n=5 em triplicata). A avaliação dos efeitos do extrato 100, 200, 400 e 800µg/g de animal, sobre a frequência cardíaca da barata, demonstrou uma atividade cardiotóxica que foi tempo-dependente. Quando a dose do HPC 100µg/g foi ensaiada houve um efeito cronotrópico positivo não significativo. Os ensaios com as doses sucessivas induziram um efeito cronotrópico negativo, que foi máximo para a dose de (800μg/g) o efeito foi de 35±3bat./min (n=6, *p≤0,05). A obtenção dos registros da força de contração muscular em animais tratados com o HPC 100, 200, 400 e 800µg/g de animal, resultou em um bloqueio neuromuscular progressivo dose e tempo-dependente. Em todos os registros ficou evidente o aparecimento de contrações espontâneas após 15-30min do tratamento com HPC. Nessa série de ensaios a dose de 800µg/g do HPC induziu o maior nível de inibição da força de contração muscular, que foi de 100% em 120min de registros (n=6, *p≤0,05). O pré-tratamento dos animais com cloral hidratado 10µg/g de animal, um bloqueador do receptor de N-metil-d-aspartato (NMDA), aumentou o tempo para o bloqueio das contrações musculares em 50%, e inibiu o aparecimento de contrações espontâneas. O pré-tratamento com a bicuculina 2,5µg/g de animal, um bloqueador dos receptores GABA, inibiu parcialmente o efeito bloqueador neuromuscular induzido pelo HPC 800µg/g (n=6, *p≤0,05). A análise do comportamento de grooming, que é caracterizado pela limpeza das pernas e antenas pelo animal, demonstrou também um efeito tempo-dependente. Nesses ensaios os valores para o grooming com solução salina foram de 153±8s/30min para pernas 75±5s/30min para antenas. Quando o DMSO 10% foi ensaiado não houve alteração das respostas, em relação ao controle salina, para o grooming de antenas e uma leve diminuição não significativa do grooming de pernas. A administração do HPC nas concentrações de 100, 200, 400 e 800μg/g de animal, induziu um aumento significativo na taxa de grooming de antenas e pernas para a menor dose que foi de 390±5s/30min para as antenas e 395±5s/30min 8 para as pernas, respectivamente (*p≤0.05). Quando as maiores doses foram ensaiadas houve uma diminuição nas respostas de grooming que foi máxima para o de antenas e pernas, culminando com a extinção da atividade com a dose de 800μg/g (n=30, *p≤0.05). Na determinação dos compostos químicos do HPC feita por ensaios de Ressonância Magnética Nuclear foram identificados três cristais com alto grau de pureza caracterizado como fitoesteróis: β-sitosterol (24α-etil-colest-5-enol) (m/z 414,71), Campesterol (24α-metil-colest5-enol) (m/z 400.68) e Stigmasterol (24α-etil-colest- 5,22-dienol) (m/z 412,69). Dos três compostos identificados, o β-sitosterol foi o mais ativo em induzir neurotoxicidade sobre o sistema nervoso periférico. Em conjunto os resultados apresentados nesse trabalho, demonstram que o extrato hexânico de Prasiola crispa induz atividade entomotóxica em modelo de Nauphoeta cinerea. Esse efeito tóxico seria prevalente sobre o sistema nervoso periférico. A indução de alterações sobre a taxa de grooming demonstra que os compostos bioativos presentes no extrato atingem o sistema nervoso central do inseto produzindo alterações complexas nessa área. O efeito cardiotóxico contribui para o desenvolvimento do efeito letal induzido pelo extrato em baratas. A determinação de compostos fitosteróis reforçam que esses compostos devam estar associados aos efeitos tóxicos observados no extrato. Ensaios fitoquímicos futuros para a determinação de novos compostos presentes no extrato poderão contrubuir para a elucidação da atividade entomotóxica.