Avaliação da composição lipídica na membrana citoplasmática de embriões bovinos produzidos in vitro e co-cultivados com vesículas multilamelares - De Rossi, Hugo [UNESP] (2019)
Embriões bovinos produzidos in vitro são mais sensíveis à preservação de células e tecidos à baixas temperaturas do que aqueles produzidos in vivo. Vários estudos têm sido conduzidos na tentativa de melhorar esse ponto crítico, e dentro desse cenário, o conteúdo lipídico intracelular e a membrana plasmática têm sido apontados como fatores determinantes para o sucesso da criotolerância. Portanto, a modificação de um ou dos dois fatores, pode minimizar a sensibilidade embrionária à criopreservação, melhorando assim as taxas de sobrevivência para essa técnica. Neste contexto, as vesículas lipídicas se apresentam como uma excelente alternativa de reposição lipídica, pois proporcionam baixa toxicidade e conseguem ser absorvidas pela membrana plasmática in vivo. Porém, até o momento não há pesquisas que avaliem o uso das vesículas lipídicas durante a produção in vitro de embriões. Portanto, o objetivo dessa dissertação foi avaliar o perfil lipídico da membrana plasmática de embriões bovinos produzidos in vitro e co-cultivados com vesículas lipídicas do tipo multilamelares (MLV). Primeiramente foi avaliado a estabilidade das vesículas lipídicas em condições de cultivo in vitro de embriões, com atmosfera, temperatura e umidade controladas. Também foi avaliado a embriotoxicidade das vesículas co-cultivadas com embriões bovinos. Para a avaliação da estabilidade foram utilizados dois meios veículos na produção das vesículas: meio de cultivo embrionário e água ultrapura, em três concentrações de vesículas: 1,0 mmol/L; 1,5 mmol/L e 2,0 mmol/L, todas as concentrações foram submetidas à dois ambientes diferentes, sem incubação (4º C) e incubadas (5% CO2 e 38,5º C) por dois períodos 24 e 48 horas. Para o teste de embriotoxicidade foram avaliados 5 grupos G1 (1,0 mmol/L), G2 (1,25 mmol/L), G3 (1,5 mmol/L), G4 (1,75 mmol/L) e G5 (2,0 mmol/L). O meio de cultivo in vitro contendo as vesículas lipídicas foi adicionado no D5, momento em que foi realizado o feeding. Os resultados obtidos pelas análises de DLS demonstraram que houve produção de vesículas utilizando meio de cultivo embrionário e que as vesículas são estáveis no ambiente de cultivo in vitro durante 24 e 48 horas. Produzindo vesículas de tamanho compatível com a zona pelúcida embrionária nos grupos meio de cultivo embrionário 1,0 mmol/L incubado por 48 horas (454,35 nm) e, meio de cultivo embrionário 2,0 mmol/L incubadas por 24 horas (380,93 nm). No teste de embriotoxicidade não houve redução na taxa de desenvolvimento embrionário (P<0,05) nos grupos co-cultivados com vesículas lipídicas G1 (43,10%), G2 (44,33%), G3 (39,85%), G4 (33,00%) e G5 (38,14%) quando comparados ao grupo controle GC (47,31%). Em conclusão, as vesículas lipídicas não apresentaram toxicidade ou letalidade quando co-cultivadas com embriões bovinos e, o meio de cultivo embrionário e ambiente controlado (incubadora) não inibiu a produção de vesículas. Posteriormente, foi avaliado o perfil lipídico da membrana plasmática de embriões bovinos produzidos in vitro e co-cultivados com vesículas lipídicas do tipo multilamelares (MLV). Para isso foram testados 4 grupos, grupo controle (GC) sem vesículas, e os grupos tratamentos G1 (1,0 mmol/L), G3 (1,5 mmol/L) e G5 (2,0 mmol/L), com vesículas. Os embriões foram submetidos ao co-cultivo com as vesículas multilamelares no quinto dia de cultivo in vitro (D5), permanecendo incubados por 48h. Os íons obtidos através da análise Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-MS) foram submetidos a análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA), onde foram selecionadas 6 espécies de lipídios de acordo com sua significância, comparando os grupos extremos (GC x G5), foi possível observar que os íons tiveram maior abundância no grupo tratado (G5) em relação ao grupo controle (GC). Os íons selecionados foram atribuídos aos fosfolipídios do tipo fosfatidilcolina, 720.6 (PCe 32:0), 754.9 (PC 32:1 ou PC 34:4), 759.0 (PC 34:2) e 781.2 (PC 34:2 ou 36:5) e glicerofosfolipídios, 779.1 (PG 42:4) e 797.3 (PG 44:5). Desses íons com maior abundância pós tratamento, dois já foram relacionados com o aumento da sobrevivência pós criopreservação (PC 32:1 ou PC 34:4 e PC 34:2). Em conclusão, o co-cultivo de embriões bovinos com vesículas lipídicas multilamelares aumentou a abundância do perfil lipídico da membrana plasmática dos embriões, o que pode aumentar a resistência dos embriões à criopreservação.