Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2012
Autor(a) principal: Gonçales Garcia, Luana [UNESP]
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/94849
Resumo: As atividades realizadas compreenderam a produção de cDNA utilizando primer anti-senso e RNA purificado, amplificação do gene codificador da proteína 25K do Cole latent virus (CoLV25K), purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, digestão enzimática com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem no vetor de expressão pET28a, transformação em células competentes de E. coli linhagem BL21-RIL, sequenciamento do gene no vetor de expressão e expressão da proteína a 37 o C . Quando expressa a 37 ºC, a proteína, de 25 kDa, foi encontrada em sua totalidade nos corpos de inclusão. Dessa forma, a proteína foi purificada sob condição desnaturante (utilizando 8 M de uréia) e submetida à diálise para seu reenovelamento. Após o reenovelamento, a proteína foi concentrada para aproximadamente 3 mg/mL e foram realizadas medidas de dicroísmo circular, para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária, e o espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados da deconvolução do experimento de dicroísmo circular indicam um percentual de 40-46% α-hélice, 12-14% folha-β, 15-22% voltas e 24-28% de outras estruturas, indicando que a proteína está estruturada; e os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável, monodispersa, mas apresenta um complexo de partículas que deve ser removido para que fique nas condições ideais de cristalização. Foram utilizadas também outras técnicas para tentar alcançar a solubilidade da proteína expressa: abaixando a temperatura...
id UNSP_01e188dc8401746b553718431f3b1caf
oai_identifier_str oai:repositorio.unesp.br:11449/94849
network_acronym_str UNSP
network_name_str Repositório Institucional da UNESP
repository_id_str
spelling Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virusProteínas - EstruturaDicroismo circularClonagemCircular dichroismAs atividades realizadas compreenderam a produção de cDNA utilizando primer anti-senso e RNA purificado, amplificação do gene codificador da proteína 25K do Cole latent virus (CoLV25K), purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, digestão enzimática com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem no vetor de expressão pET28a, transformação em células competentes de E. coli linhagem BL21-RIL, sequenciamento do gene no vetor de expressão e expressão da proteína a 37 o C . Quando expressa a 37 ºC, a proteína, de 25 kDa, foi encontrada em sua totalidade nos corpos de inclusão. Dessa forma, a proteína foi purificada sob condição desnaturante (utilizando 8 M de uréia) e submetida à diálise para seu reenovelamento. Após o reenovelamento, a proteína foi concentrada para aproximadamente 3 mg/mL e foram realizadas medidas de dicroísmo circular, para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária, e o espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados da deconvolução do experimento de dicroísmo circular indicam um percentual de 40-46% α-hélice, 12-14% folha-β, 15-22% voltas e 24-28% de outras estruturas, indicando que a proteína está estruturada; e os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável, monodispersa, mas apresenta um complexo de partículas que deve ser removido para que fique nas condições ideais de cristalização. Foram utilizadas também outras técnicas para tentar alcançar a solubilidade da proteína expressa: abaixando a temperatura...The experiments performed were, the production of cDNA using anti-sense primers and purified RNA, amplification of the gene encoding the 25K protein of Cole latent virus (CoLV25K), purification of the amplified fragment, cloning in multiplication vector pGEM-T for cell transformation into competent Escherichia coli strain TOP 10, vector purification, enzymatic digestion using the enzymes Bam HI and Hind III, subcloning in expression vector pET28a, transformation into competent cells of E. coli strain BL21-RIL, sequencing of the gene cloned into the expression vector and protein expression at 37 o C. When expressed at 37 °C, the protein with a molecular mass of 25 kDa was detected in inclusion bodies. Thus, the protein was purified under denaturing conditions (using 8 M urea) and subjected to dialysis to stimulate refolding. After refolding, the protein was concentrated to approximately 3 mg / mL and the circular dichroism assay was performed to verify the content of secondary structure, and dynamic light scattering, to estimate the size distribution of particle populations which are present in solution. The data from the deconvolution of circular dichroism experiments indicate a percentage of 40-46% α-helix, 12-14% β-sheet, 15-22% turns and 24-28% of other structures, indicating a structured protein; and the data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable, monodispersive, but forms a large complex of particles which must be separated to before crystallization experiments. Other techniques were used to solubilize the expressed protein: lowering the temperature of expression to 18 °C, using the method... (Complete abstract click electronic access below)Universidade Estadual Paulista (Unesp)Arni, Raghuvir Krishnaswamy [UNESP]Gaspar, José Osmar [UNESP]Universidade Estadual Paulista (Unesp)Gonçales Garcia, Luana [UNESP]2014-06-11T19:27:21Z2014-06-11T19:27:21Z2012-02-13info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis46 f. : il.application/pdfGONÇALES GARCIA, Luana. Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus. 2012. 46 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, 2012.http://hdl.handle.net/11449/94849000685820goncalesgarcia_l_me_sjrp.pdf33004153074P991625089789458870000-0003-2460-1145Alephreponame:Repositório Institucional da UNESPinstname:Universidade Estadual Paulista (UNESP)instacron:UNESPporinfo:eu-repo/semantics/openAccess2023-10-17T06:08:24Zoai:repositorio.unesp.br:11449/94849Repositório InstitucionalPUBhttp://repositorio.unesp.br/oai/requestopendoar:29462024-08-05T15:11:33.608668Repositório Institucional da UNESP - Universidade Estadual Paulista (UNESP)false
dc.title.none.fl_str_mv Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus
title Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus
spellingShingle Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus
Gonçales Garcia, Luana [UNESP]
Proteínas - Estrutura
Dicroismo circular
Clonagem
Circular dichroism
title_short Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus
title_full Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus
title_fullStr Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus
title_full_unstemmed Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus
title_sort Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus
author Gonçales Garcia, Luana [UNESP]
author_facet Gonçales Garcia, Luana [UNESP]
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Arni, Raghuvir Krishnaswamy [UNESP]
Gaspar, José Osmar [UNESP]
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.contributor.author.fl_str_mv Gonçales Garcia, Luana [UNESP]
dc.subject.por.fl_str_mv Proteínas - Estrutura
Dicroismo circular
Clonagem
Circular dichroism
topic Proteínas - Estrutura
Dicroismo circular
Clonagem
Circular dichroism
description As atividades realizadas compreenderam a produção de cDNA utilizando primer anti-senso e RNA purificado, amplificação do gene codificador da proteína 25K do Cole latent virus (CoLV25K), purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, digestão enzimática com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem no vetor de expressão pET28a, transformação em células competentes de E. coli linhagem BL21-RIL, sequenciamento do gene no vetor de expressão e expressão da proteína a 37 o C . Quando expressa a 37 ºC, a proteína, de 25 kDa, foi encontrada em sua totalidade nos corpos de inclusão. Dessa forma, a proteína foi purificada sob condição desnaturante (utilizando 8 M de uréia) e submetida à diálise para seu reenovelamento. Após o reenovelamento, a proteína foi concentrada para aproximadamente 3 mg/mL e foram realizadas medidas de dicroísmo circular, para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária, e o espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados da deconvolução do experimento de dicroísmo circular indicam um percentual de 40-46% α-hélice, 12-14% folha-β, 15-22% voltas e 24-28% de outras estruturas, indicando que a proteína está estruturada; e os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável, monodispersa, mas apresenta um complexo de partículas que deve ser removido para que fique nas condições ideais de cristalização. Foram utilizadas também outras técnicas para tentar alcançar a solubilidade da proteína expressa: abaixando a temperatura...
publishDate 2012
dc.date.none.fl_str_mv 2012-02-13
2014-06-11T19:27:21Z
2014-06-11T19:27:21Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv GONÇALES GARCIA, Luana. Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus. 2012. 46 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, 2012.
http://hdl.handle.net/11449/94849
000685820
goncalesgarcia_l_me_sjrp.pdf
33004153074P9
9162508978945887
0000-0003-2460-1145
identifier_str_mv GONÇALES GARCIA, Luana. Biologia estrutural: expressão e caracterização estrutural da proteína 25K do Cole latent virus. 2012. 46 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, 2012.
000685820
goncalesgarcia_l_me_sjrp.pdf
33004153074P9
9162508978945887
0000-0003-2460-1145
url http://hdl.handle.net/11449/94849
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv 46 f. : il.
application/pdf
dc.publisher.none.fl_str_mv Universidade Estadual Paulista (Unesp)
publisher.none.fl_str_mv Universidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.source.none.fl_str_mv Aleph
reponame:Repositório Institucional da UNESP
instname:Universidade Estadual Paulista (UNESP)
instacron:UNESP
instname_str Universidade Estadual Paulista (UNESP)
instacron_str UNESP
institution UNESP
reponame_str Repositório Institucional da UNESP
collection Repositório Institucional da UNESP
repository.name.fl_str_mv Repositório Institucional da UNESP - Universidade Estadual Paulista (UNESP)
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1808129844369686528