Identificação de proteínas relevantes para fase G1 do ciclo celular de Saccharomyces cerevisiae diferencialmente presentes durante desativação de eIF5A - Comar, Marco Aurélio Bambozzi [UNESP] (2020)
eIF5A é um fator de elongação da tradução conservado em arqueias e eucariotos, que interage com a subunidade maior do ribossomo 80S. É a única proteína que possui o aminoácido hipusina, formado pós-traducionalmente, essencial para sua função. eIF5A auxilia na tradução de proteínas que contêm motifs ricos em prolina, pois sequência repetida deste aminoácido pode causar parada do ribossomo em tradução devido à rigidez estrutural que forma. Na ausência de eIF5A funcional ocorre parada do ciclo celular em G1, na transição de G1 para S, tanto em Saccharomyces cerevisiae quanto em mamíferos, sugerindo papel essencial desta na tradução de proteínas importantes para a progressão do ciclo celular. Neste trabalho foi proposta a identificação das proteínas relevantes para a fase G1 que se encontram diferencialmente presentes durante desativação de eIF5A em S. cerevisiae. Foram utilizados dados de larga escala de perfil proteômico diferencial entre linhagens selvagens e mutantes de eIF5A, previamente obtido por nosso grupo, como ponto de partida para identificação das proteínas relevantes. A confirmação de níveis diferenciais destas proteínas foi realizada utilizando metodologia de Western blot após indução da desativação de eIF5A, utilizando o mutante sensível a temperatura hyp2-3. A desativação foi feita através do cultivo da linhagem mutante em temperatura semi-permissiva, que induz perda da função de eIF5A, porém mantendo viabilidade celular. Foi observado que a proteína Cka2 está diminuída durante a desativação de eIF5A, ela faz parte do complexo quinase CK2 que atua fosforilando proteínas envolvidas em diversos processos celulares, bem como o próprio ciclo celular. Também foi observado que Sic1, uma inibidora de ciclinas dependentes de quinase (CDK), que regula tipicamente a transição G1/S e através de vias que respondem a estresses, está diminuída durante desativação de eIF5A. Para também compreensão do impacto da inibição de eIF5A em mamífero, a linhagem de células de camundongo RAW 264.7 foi tratada com o inibidor da hipusinação GC7. Foi realizado ensaio de qRT-PCR em tempo real onde observou- se diminuição da expressão dos genes CCND1 (Ciclina D1), CDK4, CDK6 e E2F1, que estão diretamente relacionadas com a progressão da fase G1 do ciclo celular nos mamíferos, além de aumento da expressão dos genes CCND2 (Ciclina D2) e CDKN1A (p21), sendo p21 uma inibidora de CDK que atua inibindo a progressão de G1 para S. Em conclusão, a diminuição de Sic1 poderia indicar que as vias que a regulam se encontram normais, assim, a diminuição de Cka2, e por consequência da atividade do complexo CK2, poderia estar causando a parada em G1 na levedura, enquanto nos mamíferos este fenótipo pode ocorrer devido a diminuição da expressão de genes responsáveis pela progressão de G1 e pelo aumento da expressão da inibidora p21.