Purificação de toxina killer de Aureobasidium pullulans visando o biocontrole de Penicillium digitatum e Geotrichum citri-aurantii - Pollettini, Flávia Lino [UNESP] (2019)
O setor citrícola enfrenta vários problemas com doenças que ocorrem na pós-colheita, como o bolor verde e a podridão azeda, causados por Penicillium digitatum e Geotrichum citri-aurantii, respectivamente. O surgimento de linhagens resistentes de P. digitatum e a falta de produtos registrados no Brasil para o controle da podridão azeda levam produtores e pesquisadores em busca de métodos alternativos de controle como o uso de leveduras, sendo o fator killer um dos possíveis mecanismos de ação desses microrganismos. Diante disso, esse trabalho teve por objetivo purificar a toxina killer produzida por Aureobasidium pullulans e testá-la no controle dos fitopatógenos P. digitatum e G. citri-aurantii. Inicialmente, foram testados diferentes métodos de precipitação proteica; em seguida, com a finalidade de conhecer a composição do extrato bruto proteico de A. pullulans foi determinada a atividade proteolítica e a presença de proteínas que agem sobre receptores da parede celular, β-1,3 glucanase e quitinase. A purificação da toxina foi realizada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de gel Sephadex G-75 em tampão formiato de amônio 0,05M, pH 6,0 e cromatografia em coluna de Cellulose (Medium Fibers) em tampão citrato 0,01M, pH 4,6. Posteriormente, a purificação foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida e realizada a detecção de atividade killer em meio sólido YEPD-azul de metileno tamponado com citrato-fosfato (0,1 M pH 4,6). A identificação da toxina foi realizada por meio de espectrometria de massas (LC-MSE). Pelos resultados obtidos foi verificado que o melhor método de precipitação proteica foi etanol na proporção 2:1 (v/v etanol/sobrenadante). No estudo sobre o extrato bruto proteico da levedura foi possível observar a presença de enzimas com atividade proteolítica, atividade β-1,3-glucanase e quitinase. Durante o processo de purificação foi possível observar que a toxina killer produzida pelo isolado de A. pullulans é uma proteína de baixa massa molecular pertencente à família das ubiquitinas, que apresenta atividade killer contra os fitopatógenos P. digitatum e G. citriaurantii.