Metodologias enzimáticas envolvendo nitrilas hidratases e transaminases para aplicações em síntese orgânica - Teixeira, Iris dos Santos [UNESP] (2022)
A biocatálise consiste no uso de enzimas e outros catalisadores biológicos na transformação de substâncias orgânicas não naturais. Ela é uma ferramenta importante na síntese orgânica, já que as enzimas são seletivas, atuam em condições reacionais brandas e em solventes ambientalmente amigáveis. Entre os biocatalisadores disponíveis, as transaminases (ATAs) são enzimas dependentes de piridoxal-5-fosfato (PLP) que catalisam a transferência de grupos amino para aldeídos e/ou cetonas. Nesse trabalho foram estudadas as reações de aminação redutiva de cetonas proquirais, com foco em avaliar a presença de heterociclos e de um sistema insaturado nos compostos. Foram empregadas um conjunto de cinco enzimas selvagens recombinantes e uma enzima comercial. Quando se avaliou a presença do heterociclo na furilmetilcetona, foi observado que a conversão diminuiu drasticamente quando comparado a cetona acetofenona, indicando que a presença do heteroátomo no anel de cinco membros influenciou negativamente essa reação. Em relação a cetona α-β-insaturada 4-fenilbut-3-en-2-ona, também foi demonstrado que a conversão caiu drasticamente em relação a seu análogo saturado 1-fenil-3-butanona (78 - >99%), e esse sistema foi posteriormente estudado com maior profundidade com o auxílio de técnicas de ancoragem molecular. As nitrilas hidratases (NHases) são enzimas amplamente empregadas industrialmente, que realizam a reação de hidratação enzimática de nitrilas a suas correspondentes amidas. Nesse trabalho primeiramente foi investigada a presença de uma NHase na bactéria Lysinibacillus boronitolerans CBMAI 2094, previamente identificada como um dos microrganismos responsáveis pela biodegradação do herbicida benzonitrilado Totril® através de triagens enzimáticas. Para identificação do gene responsável pela NHase foram usadas duas abordagens: uma abordagem in silico através de técnicas de bioinformática, e também através de reações em cadeia da polimerase (PCR) investigativas. Por meio das duas estratégias não foi possível identificar o gene correspondente a enzima de interesse. Posteriormente a reação de hidratação enzimática com a NHase de Rhodococcus erythropolis foi otimizada com o uso de maior porcentagem de DMSO como cossolvente no meio reacional, melhorando os resultados de conversão para as nitrilas testadas. Por fim a NHase de R. erythropolis foi usada como molde para a obtenção de variantes enzimáticas através de mutagênese sítio dirigida. Com auxílio de ancoragem molecular para determinação da localização das mutações pontuais, foram obtidas três variantes enzimáticas: W118A, W118D e W118H e elas foram empregadas em reações com um conjunto de nitrilas.