Análise imunológica comparada da eficiência e especificidade da hialuronidase recombinante de Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae) expressa em bactéria e levedura - Jacomini, Débora Laís Justo [UNESP] (2013)
A vespa social Polybia paulista tem sido muito estudada nos campos da bioquímica, proteômica e imunologia pelas suas características de habitat, composição de seu veneno e pelas conseqüencias dos acidentes decorrentes de suas ferroadas. O cDNA de hialuronidase (GI: 302201582), um dos principais alérgenos desse veneno, foi clonado em vetores de expressão - pET-28a e pPICZA - em bactéria Escherichia coli DE3 (BL21) e em levedura Pichia pastoris, respectivamente. A proteína Hyal recombinante (Pp-Hyal-rec) de bactéria foi expressa em corpúsculos de inclusão, enquanto que a de levedura na forma solúvel. Ambas foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina Ni2+ (Ni-NTA-Agarose). A proteína nativa de Hyal (Pp-Hyal-nat) também foi obtida e purificada até a homogeneidade por meio de cromatografia de troca catiônica em coluna Hiprep FF CM, acoplado a um sistema de Akta FPLC, e as análises realizadas por espectrometria de massa em MALDI ToF/ToF-MS. Anticorpos policlonais foram produzidos em camundongos BALB/c contra a Pp-Hyal-nat e a Pp-Hyal-rec de bactéria, demonstrando alta especificidade nos testes de imunoblotting realizados. Estes alérgenos foram avaliados quanto ao reconhecimento de imunoglobulina E (IgE) Pp-Hyal-específico no soro de pacientes sabidamente alérgicos ao veneno desta vespa. Os soros imunes foram capazes de reconhecer especificamente, em maior intensidade as bandas correspondentes à proteína Pp-Hyal-rec de bactéria (43 kDa) e a Pp-Hyal-rec de levedura (37 kDa) em relação ao alérgeno Pp-Hyal-nat (39 kDa). No extrato de veneno bruto de P. paulista, os soros reconheceram outras proteínas provavelmente correspondentes aos demais alérgenos do veneno, tais como Fosfolipase (37 kDa), Antígeno 5 (25 kDa), e proteases. Os dados aqui obtidos com ambos...