Efeitos de compostos naturais sobre a atividade peroxidásica de AhpCs e sobrevivência de bactérias patogênicas - Cabrera, Vitória Isabela Montanhero (2023)
A resistência de bactérias patogênicas a múltiplos antibióticos aumentou em todo o mundo nos últimos anos, exigindo a busca de novos compostos antibacterianos. Estudos indicam que ação convergente de algumas classes de antibióticos, independente do mecanismo de ação, é a geração de espécies reativas de oxigênio (EROS), o que contribui para a morte de patógenos bacterianos. As bactérias possuem várias enzimas antioxidantes capazes de decompor as EROs, entre elas, as peroxirredoxinas 2-Cys típicas, denominadas de AhpC em bactérias, são peroxidases altamente reativas e extremamente abundantes no ambiente celular, e estudos sugerem que a atividade dessa enzima seria um fator importante para virulência de determinadas cepas bacterianas. A alta reatividade de AhpC está relacionada a uma tríade catalítica, composta por dois resíduos polares (Thr/Ser e Arg) que mantêm o enxofre da cisteína catalítica, denominada de cisteína peroxidásica (CP) na forma tiolato (S-) e estão envolvidos no direcionamento e estabilização do substrato para permitir a substituição nucleofílica bimolecular química (SN2). Apesar da importância da AhpC em bactérias, até o presente momento nenhum inibidor foi identificado para estas enzimas. Por outro lado, alguns produtos naturais foram identificados como inibidores de isoformas humanas. De forma geral estes compostos apresentam como características comuns um esqueleto hidrofóbico volumoso e um sistema carbonílico capaz de realizar uma adição de tiól-Michael. Neste trabalho, avaliamos a atividade inibitória de compostos naturais oriundos da biota costeira do estado de São Paulo sobre a atividade peroxidase de AhpC de Pseudomonas aeruginosa (PaAhpC) e Staphylococcus epidermidis (SeAhpC), duas bactérias oportunistas Gram negativas e positivas, respectivamente, responsáveis por diversas infecções hospitalares. A seleção dos compostos foi efetuada com base em características funcionais e estruturais de compostos naturais identificados para isoformas humanas. Através de ensaios bioquímicos identificamos um ácido benzoico prenilado (CN-ABP1) oriundo de Piper crassinervium foi capaz de inibir a atividade peroxidásica de PaAhpC, mas não inibiu SeAhpC ou da isoforma humana (HsPrx2). Adicionalmente demonstramos que CN-ABP1 não é capaz de inibir outras tiól enzimas. A determinação do IC50 foi de 20.3 μM e por SDS PAGE mostramos que o composto não foi capaz de realizar uma adição de tiól-Michael, indicando um modo de inibição ainda não descrito para este grupo de proteínas. Resultados de simulações envolvendo docking molecular, indicam que o composto é estabilizado no sítio catalítico com aminoácidos da tríade catalítica através de ligações polares e um grande número de interações hidrofóbicas. Neste contexto os resultados obtidos nesta investigação levaram a identificação do primeiro composto natural oriundo da biota costeira brasileira com alta especificidade para AhpC bacteriana. Como consequências diretas da investigação iniciamos procedimentos com uma série de compostos similares a CN-ABP1 visando a identificação de características estruturais/funcionais envolvidas na inibição promovida por CN-ABP1. Ainda baseado na estrutura hidrofóbica alongada do composto hipotetizamos que este poderia mimetizar um substrato biológico como peróxidos derivados de ácidos graxos de cadeia longa e resultados obtidos revelaram que AhpC possui alta afinidade por este tipo de substrato com taxas de hiperoxidação de 1.06 ´ 106M-1s-1 indicando que estes possam ser inibidores biológicos de AhpC. Visando aprofundar o conhecimento da biologia estrutural da enzima realizamos ensaios de cristalização e obtivemos cristais passiveis de difração de raios-X. A determinação da estrutura destas proteínas deve auxiliar em um maior entendimento da interação entre CN-ABP1-PaAhpC abrindo a perspectiva da identificação de outros inibidores que guardem semelhança com CN-ABP1 ou hidroperóxidos derivados de lipídeos de cadeia longa, que podem em última instancia auxiliar no combate a bactérias patogênicas resistentes a múltiplos antibióticos.