Estudo do envolvimento de eIF5A na resposta ao estresse de retículo endoplasmático em Saccharomyces cerevisiae - Klippel, Angélica Hollunder [UNESP] (2017)
O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. Embora tenha sido sugerida inicialmente uma função para eIF5A no início da tradução, foi na etapa de elongação que sua função foi melhor demonstrada. Estudos prévios mostraram que eIF5A tem algum papel na translocação de proteínas pela via co-traducional e que mutantes desse fator possuem níveis aumentados de proteínas envolvidas com o estresse de retículo endoplasmático (RE). Desta forma, nesse trabalho, foi estudada a correlação entre eIF5A e a via de resposta ao estresse de RE (Unfolded Protein Response - UPR). Considerando que o fator de transcrição Hac1 é um elemento essencial da via UPR em Saccharomyces cerevisiae, foi inicialmente verificado se eIF5A afetava o splicing citoplasmático do mRNA de HAC1, o qual é dependente da ativação de Ire1, um sensor de proteínas desenoveladas no interior do RE. Para isto, foi realizada a quantificação dos níveis de mRNA maduro e imaturo de HAC1 por meio de ensaios de qPCR e RT-PCR semiquantitativa, análises estas que não revelaram qualquer diferença de comportamento do mutante hyp2-3 de eIF5A em relação ao selvagem. Por outro lado, diferentes mutantes de eIF5A mostraram sensibilidade a DTT e resistência a tunicamicina, um comportamento ainda não descrito na literatura e que difere de mutantes da via de SRP (via co-traducional de translocação de proteínas para o RE). Além disso, este comportamento de mutantes de eIF5A não foi modificado pela superexpressão dos componentes de SRP. Ainda, o fenótipo de mutantes de eIF5A frente ao DTT e à tunicamicina difere daquele de linhagens que apresentam nocaute de proteínas ribossomais, nocaute de um fator de biogênese de ribossomo ou de um mutante dominante-negativo de eEF2 (translation elongation factor 2). Assim, estes resultados sugerem que a sensibilidade ao DTT e a resistência à tunicamicina, com a diminuição da função de eIF5A, não esteja diretamente relacionada com a via de SRP ou a um defeito geral na tradução. Também foi demonstrado que o fenótipo de resistência a tunicamicina dos mutantes de eIF5A não depende de Ire1 ou Hac1. Para entender melhor estes fenótipos dos mutantes de eIF5A, foi realizada uma determinação do perfil proteômico (utilizando a estratégia de Synthetic Genetic Array e a coleção GFP de S. cerevisiae) do mutante hyp2-3 na presença de DTT, tunicamicina ou na condição controle sem tratamento. A análise destes resultados revelou proteínas que estão diminuídas no mutante hyp2-3 em relação ao selvagem e que podem contribuir para explicar os fenótipos observados. Por fim, a análise deste perfil proteômico, assim como de outros dados obtidos nesse trabalho, não sugerem uma pré-ativação de UPR perante a diminuição da função de eIF5A em S. cerevisiae, como observado em um trabalho recente com células HeLa.