Desenvolvimento de peptídeos derivados de toxinas de serpentes com ação inibitória contra o alvo molecular Tripanotiona Redutase: um estudo in silico e in vitro - Francisco, Aleff Ferreira [UNESP] (2023)
Este trabalho aborda o desenvolvimento de inibidores para a Tripanotiona-Redutase (TR), um alvo molecular relevante em tripanossomatídeos, que por sua vez causam grande parte das mortes associadas a doenças tropicais negligenciadas. Para alcançar esse objetivo, foram empregadas ferramentas computacionais que refletem o estado da arte, incluindo AlphaFold, S4PRED, AutoDockGPU, ClusPro e Gromacs 2022, visando modelar inibidores a partir de biomoléculas encontradas em venenos de serpentes do gênero Bothrops. Inicialmente a estrutura do alvo Tripanotiona-Redutase de Leishmania brasiliensis (LbTR) foi validada através de simulações de dinâmica molecular (DM) em uma escala de microsegundos. Em seguida, foi realizada uma triagem computacional de toxinas botrópicas disponíveis no Protein Data Bank contra a LbTR, gerando 22 complexos, dos quais 12 indicaram toxinas com interação obstruindo o sítio ativo da LbTR. Logo após, um virtual screening foi realizado com cerca de 16,2 mil peptídeos derivados de toxinas botrópicas, possibilitando a seleção de quatro peptídeos com alta afinidade pela LbTR, os quais foram submetidos a simulações de DM. Adicionalmente, esses quatro peptídeos foram submetidos a um virtual screening reverso contra 14 TRs de diferentes espécies de Leishmania e Trypanosoma. A expressão recombinante da LbTR foi realizada em E. coli e purificada por cromatografia de afinidade, alcançando um rendimento de ~15 mg/L. Subsequentemente, a cinética enzimática da LbTR foi realizada utilizando o seu substrato natural, resultando na determinação do Km e Vmax de 18,8 µM e 23 µM/min, respectivamente. Posteriormente, foi realizada a caracterização biofísica da LbTR por espalhamento de luz dinâmico, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Levando em consideração o potencial dos resultados computacionais, o veneno de Bothrops jararacussu foi fracionado para o isolamento da miotoxina BthTX-I, que foi testada como inibidora da LbTR. A miotoxina exibiu um forte efeito inibitório sobre a atividade enzimática da LbTR, atingindo um IC50 de 1,9 µM. Os ensaios de interação molecular por cromatografia de bioafinidade confirmaram a ligação da BthTX-I à LbTR. Em ensaios de cinética enzimática, a BthTX-I exibiu um mecanismo de inibição do tipo misto sobre a LbTR, com um Ki de 1,88 µM e αKi de 10,69 µM. A avaliação experimental dos peptídeos selecionados in silico revelou que todos os quatro apresentam atividade inibitória em diferentes graus, sendo que o peptídeo KKFW alcançou a maior eficácia, com uma inibição de até 45% da LbTR. Em síntese, os resultados deste estudo evidenciam o potencial de toxinas de serpentes como uma fonte promissora para o desenvolvimento de inibidores eficazes para o alvo molecular estudado.