α-Arabinofuranosidase de Aspergillus hortai CRM 1919: produção, purificação, caracterização e aplicação na hidrólise de hemiceluloses de resíduos agroindustriais - Terrone, Cárol Cabral [UNESP] (2017)
Biomassa lignocelulósica é a principal fonte de carbono renovável no planeta. Seus constituintes majoritários são celulose, hemiceluloses e lignina. Hemiceluloses são polissacarídeos ramificados sendo o principal tipo as xilanas, estruturas com cadeia principal de xilose. Dentre as diversas enzimas hidrolíticas, que atuam sobre a estrutura de xilanas, estão as α-L-arabinofuranosidases, que catalisam a hidrólise de ligações entre α-L-arabinofuranosídeos e a cadeia principal do polissacarídeo. Neste trabalho, uma linhagem de Aspergillus hortai CRM1919, isolada de solo próximo a lagoas salinas e alcalinas da região da Nhecolândia no Pantanal Matogrossense, foi utilizada para produzir α-L-arabinofuranosidases. Resíduos agroindustriais foram utilizados como substrato para o cultivo do fungo. O objetivo principal foi otimizar a produção de α-L-arabinofuranosidases e aumentar a produção a fim de se obter um filtrado enzimático rico nessa atividade, para posteriormente purificá-la e aplicá-la na degradação de biomassa. A linhagem foi cultivada em meio líquido de Vogel suplementado com diferentes substratos, dentre eles alguns subprodutos da agroindústria. As maiores produções de α-arabinofuranosidases ocorreram nos cultivos com polpa cítrica e casca de laranja a 1% (m/v) em cultivos estáticos por 4 dias, com pH inicial de 2,5 e temperatura de 30 ºC. Após todas as etapas de otimização, o extrato bruto apresentou atividade quinze vezes maior do que nos cultivos iniciais. A enzima foi purificada por uma estratégia de três etapas, sendo uma precipitação com sulfato de amônio, na concentração de 25 a 65%, uma cromatografia de troca iônica e outra de exclusão molecular, apresentando ao final uma recuperação de 10,1% com um fator de purificação de 58,7. As características da α-L-arabinofuranosidase purificada foram determinadas, sendo pH ótimo de 4,0 e temperatura ótima de 60 ºC, meia vida a 30 e 40 ºC de 265 e 230 minutos, respectivamente. A maior estabilidade da enzima ao pH ocorreu em pH 5,0, A atividade enzimática foi reduzida na presença de Zn+2, PMSF, SDS e etanol a 20%, mas foi ativada na presença de Mg+2, Na+, EDTA, Tween 20, Tween 80 e Triton X-100. A α-arabinofuranosidase apresentou tolerância a presença de 0,5 e 1,0 M de NaCl no meio reacional, e alta estabilidade nas concentrações de 0,5, 1,0, 2,0 e 4,0 M de NaCl. Os parâmetros cinéticos para o substrato ρ-nitrofenil-α-L-arabinofuranosídeo foram Km de 8,73 mM, Vmáx de 7,91 μmol/min.mg e Kcat de 0,59/min. A enzima purificada apresentou afinidade apenas sobre o substrato ρ-nitrofenil-α-L-arabinofuranosídeo. Na caracterização das biomassas in natura, o bagaço de cana-de-açúcar apresentou em sua composição 30% de celulose, 16% de hemiceluloses e 20% de ligninas totais, enquanto bagaço de malte apresentou 20% de celulose, 20% de hemiceluloses e 20% de ligninas totais. Na caracterização da hemicelulose extraída, a de bagaço de cana-de-açúcar apresentou composição em açúcares redutores de 7,8% de glicose, 23,7% de xilose e 2,6% de arabinose; a hemicelulose de bagaço de malte apresentou em sua composição 20,6% de glicose, 28,3% de xilose e 9,4% de arabinose. A hidrólise das hemiceluloses e de xilanas comerciais foi realizada na presença da α-arabinofuranosidase purificada e do filtrado bruto de cultivo contendo a α-arabinofuranosidase, associados com uma xilanase purificada, também produzida por Aspergillus hortai. Em ambos os casos foi possível verificar a cooperação entre enzimas do complexo xilanolítico e a atuação sequencial de cada uma na hidrólise das estruturas de xilano.