Estudo e aplicação de sondas moleculares baseadas em dicroísmo circular induzido para determinação de sítios de ligação em albumina e caracterização de agregados amilóides - Vasconcelos, Debora Naliati [UNESP] (2019)
A proteína presente no plasma sanguíneo e conhecida como albumina humana possui inúmeras funções fisiológicas e propriedades como o transporte de fármacos e metabólitos na corrente sanguínea. Neste sentido, quando se estuda as características farmacocinéticas de um novo fármaco, entre as propriedades estudadas, busca-se elucidar a capacidade de ligação do mesmo na albumina e caracterizar o sítio de ligação da mesma. Neste projeto, estudamos as características espectroscópicas e biofísicas do corante vermelho Congo (VC) como potencial sonda para caracterização dos sítios de ligação da albumina e caracterização de agregados amiloidais. Os ensaios de supressão de fluorescência e dicroísmo circular induzido (ICD) revelaram uma forte associação entre VC e a albumina de soro bovina (BSA). Ensaios de deslocamento de sondas fluorescentes e alteração do espectro de ICD revelaram que o corante VC pode se ligar nos sitios I e II da BSA. Agregados proteicos com características de fibrilas amiloidais foram preparados por aquecimento da BSA a 70°C e caracterizados por fluorescência de tioflavina-T e espalhamento de luz Rayleigh. Observamos um deslocamento no sinal de ICD do VC ligado aos agregados. A monitoração do sinal de ICD em função do aumento de temperatura revelou uma típica curva de alteração de fase da proteína. Considerando que, quando presente, um sinal de ICD pode ser bastante específico e não sujeito às influências espectrais dos compostos presentes, propomos que esta técnica espectroscópica possa ser utilizada para auxílio na elucidação de sítios de ligação da albumina e estudos da formação de agregados amiloidais em proteínas. Estudamos também as características espectroscópicas e biofísicas do ligante divanilato de metila (DV) como potencial sonda para caracterização dos sítios de ligação da albumina e caracterização de agregados amiloidais. Combinado com os testes experimentais foram realizados os estudos de docking molecular da interação DV e albumina. Os ensaios de supressão de fluorescência e dicroísmos circular revelaram uma forte associação entre DV e as proteínas HSA e BSA. Os estudos deslocamento de ligantes e alteração do sinal de ICD do DV demostraram que o DV é capaz de se ligar a mais de um local de ligação da albumina, sítios I e II, no entanto, não foi possível distinguir em qual sítio estaria mais propenso a ocorrer a ligação. A monitoração do sinal de ICD do DV em função da temperatura revelou uma alteração na estrutura da proteína quando submetida a um aumento de temperatura que levou a perda da capacidade de ligação ao DV, como demostrado pela perda total do sinal de ICD do DV. Contudo esses resultados não permitem o uso do mesmo como um indicativo analítico de formação de agregados amiloidais, como apresentado para o vermelho Congo. Os estudos termodinâmicos e docking molecular indicaram que as forças de interações predominantes entre DV e as proteínas são interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio.