Toxicidade e criopreservação do sêmen de Astyanax altiparanae, utilizando dimetilsufóxido e metilglicol como crioprotetores - Leite, Laicia Carneiro (2019)
A criopreservação é uma tecnologia empregada para preservação de células, tecidos e embriões em baixas temperaturas. Para o desenvolvimento de tal tecnologia para a preservação seminal, é necessário o conhecimento sobre as características seminais da espécie que se pretende trabalhar, o estabelecimento de soluções diluentes que protegerão as células espermáticas e, dos respectivos protocolos de resfriamento, congelamento e descongelamento do sêmen criopreservado. As soluções crioproteroras devem ser atóxicas às células espermáticas, mantendo as características do fluido seminal. Assim, este trabalho teve por objetivos além de conhecer as características seminais do sêmen de Astyanax altiparanae, desenvolver um protocolo eficiente para a criopreservação seminal da espécie e sua utilização posterior. Para isso, exemplares adultos e maduros de A. altiparanae foram induzidos hormonalmente à reprodução com Ovopel®, sendo o sêmen coletado após 226 horas-grau em com auxílio de micropipetas. Deste foram avaliadas as características seminais como, osmolalidade, concentração espermática, motilidade espermática subjetiva e motilidade objetiva e vários outros aspectos de cinética dos espermatozoides pelo uso do CASA (Integrated Semen Analysis System). Foram avaliadas dez soluções crioprotetoras compostas por três bases diluentes A (5% de glicose + 10% gema de ovo), B (Bestville Thawing Solution (BTS®) a 5%) e C (5% de glicose), combinadas com um crioprotetor interno dimetilsulfóxido ou metilglicol, em concentrações de 10% e 15%. A eficiência destas soluções foi avaliada pela análise da motilidade espermática computadorizada. Para a criopreservação, o sêmen foi diluído na proporção de 1:25 (sêmen:diluente), envasado em palhetas de 0,25 mL e congelados em vapores de nitrogênio líquido. Também foi avaliada a integridade do DNA dos espermatozoides após descongelamento, pelo teste cometa. O sêmen apresentou-se translúcido, com consistência pouco viscosa, obtendo cerca de 30 µL de sêmen por macho. A osmolalidade média foi de 219±0,03 mOsm/kg, a concentração espermática média foi de 7,22±3,1 x109 espermatozoides/mL. A motilidade subjetiva média foi de 65%, com tempo de duração de motilidade de 33±2,2 segundos. Os valores médios obtidos pela análise do sêmen fresco com o ISAS® CASA foram: motilidade total 79,72±7,6%, motilidade progressiva 54,10±8,8% e motilidade não progressiva 25,62±8,5%, foram mensurados ainda as velocidades, VCL (47,28±15,8 µm/s), VSL (35,77±12,4 µm/s) e VAP (43,37±15,0 µm/s), LIN (75,5±6,1%), STR (82,6±4,3%), WOB (91,2±2,9%), ALH (1,3±0,1 µm) e BCF (6,9±0,3 Hz). Com relação a toxicidade os tratamentos T7 (DMSO 10% + C), T4 (MTG15% + A) e T6 (DMSO15% + B ) foram os que propiciaram melhores resultados pós diluição ao sêmen de A. altiparanae, apresentando valores s médios de motilidade total (MT) para T7 de 68,95±14,8%, T4 – MT de 61,77±4,6%, T6 - MT de 59,42±12,7%, não apresentando diferença significativa entre si. No que se refere a análise de motilidade pelos métodos subjetivo e objetivo (ISAS® CASA), o método objetivo registrou os maiores valores. Os processos de criopreservação e de descongelamento não foram eficazes em manter o sêmen viável, não sendo detectado nem motilidade, nem capacidade de fertilização em nenhum dos tratamentos testados. Com relação a integridade do DNA, nos tratamentos T1, T3, T5 e T6 foram detectados menores índices de danos.