Caracterização e imobilização da hemoglobina extracelular de Amynthas gracilis em substrato sólido visando a elaboração de biossensores de contaminação ambiental - Souza, Claudemir Oliveira [UNESP] (2018)
As hemoproteínas desempenham um papel vital nos organismos. Dentre elas, as hemoglobinas extracelulares gigantes (Hbs) se destacam por sua alta cooperatividade, alta estabilidade oligomérica, grande afinidade para ligação com oxigênio e resistência à oxidação. Devido estas propriedades, as Hbs apresentam um grande potencial biotecnológico, como é o caso de estudos buscando protótipos de substituição sanguínea e elaboração de biossensores. Porém, o uso das hemoglobinas gigantes em biossensores para detecção de metais pesados ainda não é encontrado na literatura, este tipo de biossensor agiliza e diminui o custo das análises de empresas e agências de fiscalização ambiental, obtendo o resultado in loco. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi verificar a sensibilidade da hemoglobina de Amynthas gracilis (HbAg) com os metais cobre e cádmio em diferentes valores de pH e imobilizá-la em substrato sólido com o auxílio dos seguintes polímeros: o catiônico polietilenoimina (PEI) e o aniônico hidrocloreto de polialilamina (PAH). Os estudos por absorção ótica, espalhamento de luz (LSI), dicroísmo circular (CD) e fluorescência da interação da HbAg em função da concentração do metal pesado cobre no pH 7,0 mostraram que a concentração de 30 μmol.L-1 é uma concentração crítica onde observa-se uma maior oxidação do grupo heme, agregação e dissociação da proteína, além de alteração em suas α- hélices. No pH 5,0 foi observada oxidação do grupo heme mas sem alterações nas estruturas secundárias da HbAg e formação de agregados. As análises dos espectros de absorção ótica, CD, fluorescência e LSI da HbAg na presença de diferentes concentrações do metal pesado cadmio não apresentaram mudanças significativas quando comparadas com o espectro da HbAg nativa. A imobilização da HbAg em PEI no pH 7,0 foi monitorada por absorção ótica e voltametria cíclica, entretanto a HbAg não foi possível imobilizar a HbAg no polímero PAH no mesmo valor de pH, sugerindo que a interação da HbAg com os biopolímeros se deve por interações eletrostáticas. A imobilização da HbAg em PEI manteve as características da hemoglobina em pH 7,0. A hemoglobina apresentou respostas ao cobre nas medidas de voltametria cíclica realizadas em concentrações de até 20 μmol.L-1 do metal, evidenciando o grande potencial de biossensoriamento do sensor fabricado. Assim, nestes estudos foi possível verificar que a HbAg na presença de cobre em pH 7,0 se oxida, agrega e dissocia, enquanto que em pH 5,0 ela apresenta apenas oxidação. Na presença de cádmio, a HbAg não apresentou nenhuma alteração através das técnicas avaliadas. Com isso, sugere-se que a HbAg pode ser utilizada como um biossensor de indicação de presença de concentrações micromolares do metal pesado cobre.