Estudos estruturais comparativos entre as importinas-α de Homo sapiens e de Mus musculus - Silva, Tainá Dorte da [UNESP] (2022)
Uma das vias de transporte melhor caracterizada é mediada pela Importina-α (Impα), chamado via clássica de importação nuclear. Nesta via, a Importina-β (Impβ) se liga à Impα, afastando o domínio auto inibitório da Impα, permitindo o reconhecimento e a ligação das sequências de localização nuclear (NLS) presentes nas proteínas a serem importadas. Já foram identificadas diversas variantes da Impα em diferentes organismos, as quais foram classificadas em três subfamílias (α1, α2 e α3) baseado na similaridade sequencial entre elas. A Impα de Homo sapiens possui sete variantes, sendo que a sua variante α1 possui alta similaridade com a variante α2 de Mus musculus (MmImpα), primeira Impα de mamífero a ser estruturalmente elucidada e amplamente utilizada no estudo de processos de importação nuclear. Além disso, com o avanço nos estudos nesta área, as estruturas das Impα de humano, fungo e arroz foram elucidadas, revelando que estas estruturas são altamente conservadas, mas apresentam diferentes características, como a afinidade à diferentes NLSs, em razão das regiões adjacentes aos sítios de ligação da Impα. Ainda existem poucas informações acerca destas diferenças, apesar da grande importância acadêmica e farmacológica, devido a especificidade do transporte proteico. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo a produção da variante α1 da HsImpα e sua comparação estrutural com a MmImpα, e o estudo da interação entre a HsImpα e os peptídeos NLS SV40, XPG1 e PAC-3. Para tal feito, foram realizadas a transformação, expressão e purificação da proteína HsImpα, bem como a análise estrutural com as técnicas de espalhamento de luz dinâmico (DLS), dicroísmo circular (CD) e espectroscopia de fluorescência (FS). A análise da afinidade dos complexos HsImpα/XPG1-NLS, HsImpα/SV40-NLS e HsImpα/PAC-3 foi realizada com a técnica de calorimetria por titulação isotérmica (ITC). O CD mostrou que a HsImpα possui estrutura similar à outras Impα, apresentando, majoritariamente, hélices-α em sua estrutura. O DLS e o FS da amostra da HsImpα isolada mostram que há uma possível oligomerização quando submetida ao aumento gradual da temperatura (5 ºC a 25 ºC), sendo que a 5 ºC ela se mostra majoritariamente monomérica. Já a análise dos resultados de DLS e FS do complexo HsImpα/SV40-NLS mostram que há uma melhor estabilização do complexo na presença da NLS. Quando analisada a amostra da HsImpα isolada pela técnica de FS, medindo diferentes amostras para cada temperatura (5, 10, 20 e 25 ºC, foi observado que não há a oligomerização. A FS do complexo HsImpα/SV40-NLS, também medida uma amostra para cada temperatura (5, 10, 20 e 25 ºC), sendo observado pequenas variações na exposição dos triptofanos, indicando que a afinidade do complexo é baixa, posteriormente confirmada com a técnica de ITC. A mesma análise de FS foi empregada para o complexo HsImpα/XPG1-NLS, sendo observado que há ligação em todas as temperaturas analisadas. Esta ligação se mostra forte e favorável, quando analisada pelo ITC, assim como já observado com a MmImpα em outro estudo realizado por nosso grupo. Foi realizado também a análise da HsImpα com peptídeo NLS de outro organismo (fungo), PAC-3-NLS com ITC, resultando que a afinidade do complexo não pode ser determinada, pois os termogramas obtidos não foram reprodutíveis, diferente do observado em outro estudo com a MmImpα, em que a afinidade do complexo é alta. Experimentos de co-cristalização estão sendo realizados visando a obtenção dos detalhes da interação dos complexos, sendo obtidos pequenos cristais que precisam ser otimizados. Os resultados apresentados indicaram uma possível oligomerização da Impα truncada quando isolada, porém, quando complexada com peptídeos NLSs de alta afinidade, como a XPG1, a proteína é majoritariamente monomérica. Possíveis diferenças na estequiometria e na afinidade do complexo HsImpα/XPG1-NLS em comparação com o MmImpα/XPG1-NLS podem indicar o modo de interação diferente entre eles. Estes resultados fortalecem a importância dos estudos entre as Impα e NLSs de diferentes organismos, extremamente importante para futuros estudos farmacológicos.