Caracterização funcional, bioquímica e na resposta a estresse das ATPases RVB-1 e RVB-2 e da ciclina PCL-1 no fungo filamentoso Neurospora crassa - Campanella, Jonatas Erick Maimoni [UNESP] (2022)
O fungo Neurospora crassa está entre os organismos mais bem compreendidos, sendo um fungo filamentoso amplamente utilizado como organismo modelo. Em nosso laboratório, diferentes proteínas foram previamente identificadas como reguladoras do metabolismo de glicogênio em diferentes condições de crescimento. Neste trabalho, algumas destas proteínas foram mais detalhadamente caracterizadas do ponto de vista bioquímico e funcional. A função da ciclina PCL-1, anteriormente identificada como uma proteína parceira da quinase PHO85-1, foi mais amplamente investigada mostrando funções adicionais à regulação do ciclo celular e metabolismo de glicogênio. Foi demonstrado que esta ciclina atua também na resposta a estresse, principalmente aquele induzido por altas concentrações de cálcio extracelular, possivelmente através da fosforilação de CRZ-1, um fator de transcrição responsivo a cálcio. O conjunto de resultados mostra o papel multifuncional desta ciclina no fungo N. crassa, diferente da levedura Saccharomyces cerevisiae, na qual ciclinas de uma família são direcionadas às mesmas funções celulares. A proteína RVB-1, anteriormente identificada como capaz de se ligar ao promotor gsn, foi também amplamente caracterizada neste trabalho. RVB-1, juntamente com sua paráloga RVB-2, pertence à família AAA+ ATPases (ATPases Associated with Diverse Celular Activities) conhecidas por interagir com múltiplos complexos proteicos incluindo remodeladores da cromatina e amplamente associadas ao desenvolvimento celular e câncer. Ambas as proteínas são essenciais ao fungo, tem localização nuclear e influenciam no seu desenvolvimento e produção de metabolitos secundários. O complexo RVB-1/RVB-2 foi produzido na forma recombinante em E. coli e caracterizado quanto aos aspectos estruturais e bioquímicos. O complexo mostrou atividade ATPase, capacidade de se ligar a fragmentos de DNA e apresentou diferentes formas oligoméricas em solução, sendo que a presença dos nucleotídeos ATP/ADP influencia no estado de oligomerização. A expressão de ambas as proteínas é modulada por diferentes estresses e ensaios de imunoprecipitação da proteína RVB-1 levaram à identificação de numerosas proteínas parceiras. Algumas interações foram caracterizadas neste trabalho. A interação in vivo com a proteína glicogenina (GNN), juntamente com a redução no conteúdo de glicogênio nas linhagens mutantes rvb-1het e rvb-2het indicou a participação do complexo na regulação do metabolismo de glicogênio. A interação in vitro com a parceira shugoshin (SGO-1), descrita como guardiã da resposta ao estresse térmico em mamífero, foi demonstrada comprovando o papel na resposta ao estresse. Finalmente, linhagens do fungo mutantes em componentes de complexos de remodelagem de cromatina, identificados como parceiros, são severamente sensíveis a estresse, evidenciando um papel funcional ainda não descrito para estas proteínas: a participação na resposta a estresse.