Validação de um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo e sequenciamento genético para detecção e caracterização de espécies e genótipos de Cryptosporidium em amostras fecais de aves - Santana, Bruna Nicoleti [UNESP] (2021)
Protozoários do gênero Cryptosporidium infectam o trato gastrintestinal e, ocasionalmente, os tratos respiratório, biliar e urinário, causando doença clínica e subclínica em aves. O diagnóstico espécie-específico da criptosporidiose é comumente realizado pela nested PCR convencional seguida de sequenciamento genético. O objetivo deste trabalho foi validar um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo (nPCR-TR-1T) seguida da análise da curva de dissociação e de sequenciamento genético para detectar e caracterizar as espécies e genótipos de Cryptosporidium em aves. A reação foi padronizada com utilização do SsoFast® EvaGreen Supermix (Bio-Rad) e do equipamento para PCR em tempo real CFX96 (Bio-Rad). Um total de 443 amostras de DNA genômico de aves foi analisado pela nested PCR convencional e pela nPCR-TR-1. Após a validação, a nPCR-TR-1T foi utilizada para determinar a ocorrência de Cryptosporidium spp. em frangos de corte em 64 núcleos comerciais de frangos de corte (NCFC) na região oeste do estado de Santa Catarina. Pela nested PCR convencional, foi observada positividade para Cryptosporidium spp. em 36/443 (8,1%), em contraste com a nPCR-TR-1T, que apresentou 90/443 (20,3%) amostras positivas para Cryptosporidium spp. O teste de sensibilidade analítica mostrou que a nPCR-TR-1T detecta aproximadamente 0,5 oocisto (2 esporozoítos) por reação. A avaliação da especificidade analítica não revelou amplificação de microrganismos que comumente apresentam amplificação inespecífica com primers utilizados para diagnóstico de Cryptosporidium spp. O cálculo da repetibilidade evidenciou o mesmo resultado em 27 de 30 amostras (90%). Em relação à reprodutibilidade da nPCR-TR-1T, foi observado o mesmo resultado em 24 das 30 amostras examinadas (80%). Foi possível realizar o sequenciamento em todas as 90 amostras amplificadas pela nPCR-TR-1T. As seguintes espécies foram identificadas: C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi e Cryptosporidium genótipo I em aves. O sequenciamento dos fragmentos amplificados pela nested PCR convencional foi possível em 10/38 (26,3%) das amostras positivas, com identificação das mesmas espécies identificadas pela nPCR-TR-1T. A ocorrência observada nos NCFC foi de 0,2% (1/64), com identificação de C. baileyi em uma amostra. Os resultados observados demonstram que a nPCR-TR-1T, em comparação com a nested PCR convencional, apresenta mais rapidez para obtenção dos resultados, menor possibilidade de contaminação com produtos amplificados e menor consumo de reagentes, pois ela é realizada em somente uma etapa e os resultados são obtidos em tempo real, sem necessidade de eletroforese em gel de agarose.