Células tronco embrionárias e induzidas ao estado de pluripotência em bovinos: características moleculares e aplicação em quimeras embrionárias - Botigelli, Ramon César [UNESP] (2021)
Células tronco pluripotentes são uma ferramenta fundamental para os estudos da embriologia, para o desenvolvimento de estudos clínicos in vitro, para a medicina regenerativa e mais recentemente, para a produção de gametas in vitro. Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cells ou iPSCs). No entanto, condições ambientais e de cultura in vitro, como a utilização de diferentes suplementos para a manutenção da pluripotência podem diminuir e modular a eficiência da reprogramação à pluripotência. Dessa forma, a presente tese teve como objetivo estudar os efeitos do oxigênio e de diferentes suplementos para a manutenção da pluripotência no cultivo e reprogramação de células iPSCs de bovinos (biPSCs). No primeiro estudo, fibroblastos fetais de bovinos foram reprogramados em diferentes tensões de oxigênio (baixo ou alto oxigênio) e diferentes suplementos para a manutenção de pluripotência, bFGF ou bFGF+LIF+CHIR+PD (bFL2i). Em nossas condições experimentais, baixo oxigênio não aumentou a eficiência de reprogramação quando comparada a reprogramação em alto oxigênio. Por outro lado, a suplementação bFL2i aumentou a eficiência de reprogramação das biPSCs. As biPSCs derivadas com bFL2i em baixo oxigênio indicaram ausência de habilidade de auto renovação. As linhagens caracterizadas foram positivas para fosfatase alcalina, positivas para a expressão de genes marcadores de pluripotência (SOX2, OCT4 e STELLA), no entanto, negativas para NANOG. Ainda, baixo oxigênio aumentou a expressão de GLUT1 e GLUT3. As biPSCs também foram positivas na imunofluorescência para OCT4 e SOX2, mas negativas para NANOG. As biPSCs foram competentes em formar corpos embrióides e estes expressão marcadores de mesoderme e ectoderme, ainda, uma linhagem apresentou expressão de endoderme. No segundo estudo, fibroblastos fetais de bovinos foram reprogramados com diferentes suplementos para a manutenção da pluripotência (fatorial 2x2; bFGF, bFGF2i, LIF, LIF2i), ainda, linhagens de células tronco embrionárias foram isoladas para serem comparadas com as biPSCs geradas. A reprogramação de biPSCs foi mais eficiente com bFGF. As linhagens derivadas com LIF2i indicaram ausência de habilidade de auto renovação. As linhagens biPSCs e bESCs foram positivas para fosfatase alcalina. As biPSCs e bESCs foram positivas para a expressão de genes marcadores de pluripotência (SOX2, OCT4, STELLA, LIFr e OTX2) e somente as biPSCs expressaram NANOG e ESRRb. Ainda, biPSCs e bESCs foram positivas para SOX2, OCT4 e H3K27me3, negativas para NANOG na imunofluorescência. As biPSCs e bESCs foram competentes em formar corpos embrióides, estes expressaram marcadores de mesoderme, ectoderme e endoderme. Ainda, nossos resultados indicaram que em nossas condições, as biPSCs foram mais competentes comparadas as bESCs para a contribuição de blastocistos quiméricos quimeras. Por fim, nossos resultados demonstram que a reprogramação de biPSCs é possível em baixo e alto oxigênio. No entanto, a suplementação LIF2i e bFL2i (baixo oxigênio) não promoveram a auto renovação das biPSCs. Também, as biPSCs e bESCs geradas e isoladas apresentaram características de pluripotência, onde, biPSCs foram mais competentes em contribuir em quimeras embrionárias