Estudo de hemicelulases através de RT-qPCR e expressão heteróloga - Leonel, Tatiane Fernanda [UNESP] (2021)
A produção de energia e de químicos renováveis a partir de resíduos agroindústrias de origens lignocelulósicas se tornou uma alternativa viável para minimizar os impactos causados pela utilização de combustíveis de origem fóssil. Porém, tal processo envolve altos custos, tendo em vista a recalcitrância da parede celular vegetal, o que dificulta a liberação de açúcares fermentáveis, fazendo-se necessário o uso de etapas de pré-tratamento e hidrólise frequentemente conduzidas em condições de concentração de reagentes químicos, temperatura e pressão elevadas, o que resultam na produção de metabólitos secundários e tóxicos indesejáveis. Assim, diversos estudos estão sendo realizados a fim de otimizar o processo de sacarificação da biomassa lignocelulósica, proporcionando um produto final menos oneroso e menos tóxico. Algumas enzimas de origens microbiológicas já estão sendo estudadas para serem utilizadas nessa etapa, sejam estas de função celulolítica, hemicelulolítica, lignocelulolítica ou mesmo auxiliar, porém a falta de eficiência, aliada ao alto custo de produção tem demandado a busca por novas moléculas para desconstrução da parede celular em formulações de coquetéis enzimáticos mais efetivos. Diante disto, o presente estudo teve por objetivo estudar duas hemicelulases da família GH2 de β-manosidases, obtidas por prospecção in silico e anotadas à partir do genoma da bactéria Chitinophaga sp. CB10 que foi isolada de um consórcio microbiano enriquecido a partir de uma pilha de bagaço de cana-de-açúcar. CB10 demonstrou ser uma fonte rica em carboidrases, com 350 domínios CAZyme previstos, o que pode explicar sua capacidade de se desenvolver a partir de carboidratos de diferentes complexidades estruturais: glicose, carboximetilcelulose, galactomanana, goma Aloe vera e bagaço de cana-de-açúcar. O bagaço da cana-de-açúcar é uma fonte rica em polímeros complexos, de forma que a diversidade de metabólitos liberados pela hidrólise enzimática destes polímeros tem um papel importante para a química verde, incluindo a hidrólise por vias enzimáticas minoritárias, como é o caso da degradação de conjugados de manana. Nesse sentido, CB10 demonstrou níveis de aumento consideráveis de expressão gênica para mananases na presença de bagaço de cana-de-açúcar como única fonte de carbono, quando comparado aos níveis de expressão em glicose (controle). Estes aumentos apresentaram respectivos níveis de 4,8x para o gene CB10-00347, localizado dentro de um agrupamento gênico identificado como “Polysaccharide Utilization Loci” (PUL), e 5,6x de aumento para o gene CB10-153.446, não associado a nenhum cluster enzimático. Essas enzimas compartilharam menos do que 45% de identidade com enzimas caracterizadas do gênero Chitinophaga pertencente ao filo Bacteroidetes. O grau de novidade - conforme demonstrado pela baixa identidade com enzimas caracterizadas anteriormente; a notável capacidade de crescer em diferentes substratos; a confirmação de atividade de mananase, evidenciada pela liberação de oligossacarídeos residuais no cultivo com galactomanano (HPLC-RID, 12,3 mMol); associados à capacidade de expressar mananases em uma baixa concentração de condições indutoras (bagaço-de-cana contém cerca de 0,2% de manose) indicam o alto potencial para a aplicação de CB10 como fonte de enzimas na produção de oligossacarídeos conjugados de manose a partir de biomassa. Além destes resultados, grandes esforços foram empreendidos com o intuito de compreender melhor a atividade de uma das enzimas preditas para β-manosidase (ORF CB10_153.446) utilizando ensaios de expressão heteróloga de proteína recombinante. Entretanto, apesar de diversas tentativas de otimização, não houve êxito na estratégia de expressão proteica em E. coli Bl21 DE3, sendo necessários novos estudos para usufruir do potencial biotecnológico demostrado pelas demais técnicas utilizadas, visando aplicação biotecnológica em biorrefinarias de precursores pré-bióticos e outros oligossacarídeos funcionais focados no indústrias alimentícias e farmacêuticas