Reprogramação de fibroblastos de pele e células do cordão umbilical por meio de plasmídeos virais e transposons na produção de iPS equinas - Guastali, Midyan Daroz [UNESP] (2016)
As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco abordam um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é necessário estudar conceitos básicos da biologia das células-tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células-tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de vetores virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, sequências de DNAs capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem multipotentes podem melhorar a eficiência de obtenção de células de pluripotência induzida (iPS) em comparação ao uso de fibroblastos, pouco eficientes ao serem reprogramados. O objetivo deste trabalho foi obter iPS por meio de mecanismo viral e não-viral de fibroblastos adultos e células do cordão umbilical equino, visando observar qual o tipo de infecção e qual o tipo de célula é mais eficiente para reprogramação celular. Ambos os tipos celulares foram infectados com vetores virais e transposons contendo os genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, KLF-4; as células transformadas foram avaliadas quanto a morfologia, imunocitoquímica e citometria de fluxo com os marcadores típicos de células-tronco pluripotentes e também quanto as alterações causadas no perfil de expressão gênica das células pelo método de PCR em tempo real; por fim as células reprogramadas foram induzidas a se diferenciarem em tecidos dos 3 folhetos germinativos. Os resultados demostraram que tanto os fibroblastos quanto as células do cordão umbilical submetidos à infecção viral apresentaram características de células pluripotentes como morfologia característica, marcação positiva para fatores de pluripotência e expressão gênica específica. Os corpos embrióides formados também apresentaram marcação imunocitoquimica para ectoderme, mesoderme e endoderme. Apesar do tempo para inicio da formação das colônias serem parecidos (7 dias para os fibroblastos e 6 dias para as células do cordão umbilical), a expansão das colônias dos fibroblastos reprogramados foi lenta, com a 1ª passagem realizada 30 dias após a infecção em comparação com as colônias de cordão umbilical, nas quais a 1ª passagem foi realizada após 15 dias. Não foi verificada reprogramação efetiva as infecções com transposons em nenhum dos dois tipos celulares. Conclui-se que o método de infecção por vetor viral em células do cordão umbilical é mais eficiente do que em fibroblastos e que em ambos os tipos celulares, o mecanismo de transposons não resultou em células reprogramadas.