Avaliação do efeito da 2-chalcona mediada pela terapia fotodinâmica nos biofilmes mono e dual-espécies de Candida spp. e dermatófitos e mecanismos de interação desses microrganismos no biofilme misto - Bila, Níura Madalena [UNESP] (2022)
As dermatomicoses são causadas por uma variedade de fungos, sendo os dermatófitos e as leveduras os de maior prevalência, na forma isolada ou associada. Os fungos dermatófitos e as espécies de Candida são capazes de formar biofilmes, que são associados ao aumento da virulência, da resistência aos fármacos e, consequentemente, da persistência da infecção. Assim, há necessidade de estudos de biofilmes com estes fungos e ampliação do arsenal terapêutico. O estudo pretendeu aprofundar o conhecimento sobre os biofilmes mono e dual espécies de Candida e dermatófitos e avaliação da acao antifúngica da 2-hidroxichalcona (2-chalcona), sua toxicidade e mecanismo de ação. Para tal, foi estudada a formação de biofilmes de Microsporum canis, e a capacidade antibiofilme da 2-chalcona no escuro e mediada por terapia fotodinâmica (PDT), a sua toxicidade in vitro em modelo de monocamada celular (2D) e em modelo tridimensional (3D) em linhagens de queratinócitos de pele humana (HaCat) e fibroblasto dérmico humano (HDFa) e, in vivo em larvas de Caenorhabditis elegans e Galleria mellonella. Além disso, foram estudados os fatores que promovem a inibição na interação dos dermatófitos e C. albicans/C. parapsilosis nos biofilmes. Os biofilmes de M. canis foram caracterizados por meio de quantificação da atividade metabólica, biomassa, estruturas polissacarídicas e matriz extracelular em RPMI 1640, caldo BHI, DMEM e HAM-F12. Os testes de sensibilidade foram conduzidos em isolado clínico de M. canis e cepas de referência de Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, C. albicans e C. parapsilosis frente à 2-chalcona e aos antifúngicos convencionais. A 2-chalcona (no escuro e mediada pela PDT) e antifúngicos convencionais foram avaliados quanto à capacidade de inibir as células planctônicas (106 cel/ml) e os biofilmes, mono e dual-espécies, no estágio inicial e maduro. Os danos causados pela 2-chalcona nos biofilmes foram documentados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal (MC). Foram quantificados os esteróis da membrana, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), os danos causados na parede celular e mecanismo de morte em células tratadas com 2-chalcona no escuro e fotoexcitada. Foi também avaliada o efeito do sobrenadante livre de células dos biofilmes de T. rubrum, C. albicans ou de C. parapsilosis quanto a capacidade de inibir os biofilmes e a filamentação de C. albicans por meio de redução de XTT, MEV e MC. M. canis foi capaz de formar biofilmes robustos em 96 horas de incubação nos meios BHI, DMEM e HAM-F12 e em menor escala no meio RPMI-1640. A 2-chalcona inibiu os biofilmes no estágio inicial e maduros de dermatófitos em concentrações superiores ou igual a 31,25 mg/L. Quando a 2-chalcona foi mediada pela PDT, houve redução das concentrações de inibição nas células planctônicas e nos biofilmes em quatro vezes quando comparada com a 2-chalcona no escuro. Os resultados de imagem por MEV e MC mostraram um total colapso das células com expressiva redução da espessura dos biofilmes. Já nos biofilmes de Candida e biofilmes dual-espécies, a 2-chalcona mostrou-se menos potente, embora a fotoexcitação tenha reduzido a sua concentração inibitória mínima. Os biofilmes de dermatófitos foram resistentes ao fluconazol e à terbinafina, assim como nos biofilmes mono e dual espécies frente ao itraconazol, fluconazol e caspofungina. Toxicidade da 2-chalcona no escuro e fotoexcitada foi observada em concentrações acima de 125 mg/L nos modelos 2D e 3D de células e C. elegans. Em G. mellonella, a 2-chalcona não mostrou toxicidade até em concentrações de 200 mg/kg. O tratamento com a 2-chalcona causou deformidade na parede celular fúngica, redução de esteróis da membrana citoplasmática e promoveu a geração de ROS, resultando, por conseguinte, em morte celular por apoptose e necrose. Os sobrenadantes livres de célula não reduziram as atividades metabólicas dos biofilmes, no entanto, houve redução de sua espessura. Verificou-se ainda que a inibição da filamentação de C. albicans nos biofilmes mistos de T. rubrum e C. albicans foi influenciada pela interação direta entre os microrganismos. Sendo assim, este estudo abre portas para desvendar a os mecanismos de interação entre microrganismos no biofilme misto e aponta a 2-chalcona mediada por PDT como uma alternativa terapêutica potente para o tratamento das dermatofitoses.