Estudo funcional de desoxi-hipusina sintase de Leishmania major utilizando o modelo de Saccharomyces cerevisiae - Silva, Suelen Fernandes [UNESP] (2019)
O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em eucariotos e arqueas e sofre uma modificação pós-traducional exclusiva, chamada hipusinação. A enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) atua nessa modificação catalisando a primeira etapa: a transferência da porção 4-aminobutil da molécula de espermidina para um resíduo específico e conservado de lisina de eIF5A. Essa enzima é um bom alvo terapêutico para doenças negligenciadas, tendo em vista suas diferenças estruturais entre espécies de parasitas. Dessa forma, nesse trabalho foi realizado o estudo funcional e caracterização das duas isoformas de DHPS de Leishmania major, denominadas de isoforma A (LmDHPSA) e isoforma B (LmDHPSB). Foi realizada a clonagem de diferentes construções dessas proteínas no vetor de expressão em E. coli pNIC28-Bsa4. Algumas dessas proteínas foram purificadas em larga escala, mas não apresentaram atividade enzimática in vitro. Também foi realizada clonagem dos genes para essas proteínas em vetor de expressão em Saccharomyces cerevisiae, em 3 diferentes construções, pSP-LmDHPSA (contendo a isoforma A), pSP-LmDHPSB (contendo a isoforma B), pSP-LmDHPSAB (contendo as duas isoformas). Apenas o plasmídeo contendo as sequências codificantes para as isoformas A e B de DHPS de Leishmania major, pSP-LmDHPSAB, foi capaz de complementar a deleção do gene essencial que codifica DHPS em S. cerevisiae, DYS1, indicando que essa enzima atue como um heterocomplexo, assim como a enzima de Trypanosoma brucei. Essa linhagem de S. cerevisiae expressando as enzimas DHPS de L. major apresentou taxa de crescimento e hipusinação aproximadamente 25% inferior à linhagem expressando DHPS de humano. Além disso, é possível que existam diferenças entre o sítio de ligação ao GC7 entre essa espécie e a DHPS de humano, uma vez que o análogo estrutural da espermidina, GC7, potente inibidor da DHPS de humano, não apresentou capacidade inibitória significativa na linhagem expressando as enzimas DHPS de L. major. Visando investigar a ausência de sensibilidade ao GC7, foram comparados estruturalmente os sítios ativos da DHPS de Trypanosoma brucei, Homo sapiens e Leishmania major (para esta última foi gerado um modelo por homologia). Há uma alta conservação entre os sítios funcionais de DHPS de L. major e T. brucei com o sítio de H. sapiens. No entanto, a isoforma A de L. major apresenta grandes extensões em sua sequência, possuindo um total de 601 aminoácidos, enquanto as demais DHPS possuem, aproximadamente 400 aminoácidos. Tais semelhanças e diferenças estruturais serão investigadas futuramente, pois podem levar à descoberta de compostos específicos para DHPS de Leishmania.