Caracterização bioquímica e biofísica de enzima ácido ferúlico descarboxilase e aplicação na produção de 4-vinilguaiacol a partir de ácido ferúlico - Navarrete, Vitória Gonçalves (2023)
A crescente valorização dos processos industriais sustentáveis e limitações na obtenção de alguns produtos de importância industrial têm tornado a tecnologia enzimática uma alternativa cada vez mais oportuna. A biossíntese de compostos permite produção contínua, sem impacto ou interferência sazonal, maior controle e otimização de parâmetros e maior especificidade dos produtos. A enzima ácido ferúlico descarboxilase (FADase) catalisa a descarboxilação não oxidativa do ácido ferúlico (AF) em 4-vinilguaiacol (4VG), um composto fenólico volátil utilizado como aromatizante em alimentos e bebidas. O 4VG, composto com aroma picante de cravo, é um produto de interesse industrial cuja demanda não é suprida por fontes naturais e com alto custo de produção por via química. Com a finalidade de entender a dinâmica estrutural e parâmetros funcionais da FADase heteróloga, derivada do gene da bactéria Klebsiella pneumoniae, para aplicação na produção de 4VG, foram realizados estudos bioquímicos e biofísicos da enzima. Para futura aplicação em processos industriais de produção, também foram realizadas tentativas de imobilização da enzima. Os testes de capacidade de conversão de AF em 4VG pela enzima purificada e em extrato bruto tiveram consumo de substrato e formação de produto foram confirmados por HPLC. A temperatura e pH ótimos determinados foram 40 oC e pH 5,5, e a faixa de estabilidade variou entre 35 oC e 50 oC e pH 5,0 a 5,5. O melting point de 60 oC foi determinado por Differential Scanning Calorimetry (DSC) e a investigação de um possível estágio intermediário de desenovelamento foi feito por Circular Dichroism (CD) nas faixas de 218 e 222nm, que apontou apenas dois estágios. A modelagem computacional da enzima possibilitou a confirmação da estrutura, seu sítio catalítico e sugeriu compatibilidade com glutaraldeído como agente reticulante a ser utilizado para imobilização. Nos ensaios de imobilização com CLEAs (cross-linked aggregates) e m-CLEAs (magnetic cross-linked aggregates), observou-se perda da atividade da enzima. Visando o entendimento deste resultado, a interação da FADase com o ligante foi analisada por espectroscopia de fluorescência, a partir da qual foram determinados dois sítios de ligação e uma constante de associação muito baixa para que a ligação fosse estável. Entretanto, estes resultados ainda são inconclusivos e novos ensaios são necessários para se definir as condições de imobilização adequadas para a enzima.