Desenvolvimento de sondas fluorescentes para determinação de sítios de ligação em albumina: estudo da relação entre estrutura molecular, constante de associação e especificidade - Bertozo, Luiza de Carvalho [UNESP] (2021)
A albumina sérica humana, HSA, é a principal proteína do plasma sanguíneo e responsável pelo transporte de compostos endógenos e exógenos. As propriedades farmacocinéticas de um fármaco podem ser alteradas devido a sua interação com a albumina. Por isso, quando um novo fármaco está em desenvolvimento, a sua interação com a albumina é extensivamente estudada, sendo, por exemplo, determinado sua constante de associação e sítios de ligação na albumina, sítio I ou sítio II. A determinação do local preferencial de ligação de um novo composto pode ser realizada por estudos de competição envolvendo sondas fluorescentes. Neste contexto, se destaca os aminoácidos dansilados, que são sondas fluorescentes que possuem especificidade pelo sítio I ou pelo sítio II da HSA. O levantamento crítico da literatura mostra que os aminoácidos dansilados de sítio I são menos aplicados como sondas do que os de sítio II, isso porque, eles parecem apresentar menor especificidade. Neste trabalho estudamos a interação entre oito aminoácidos dansilados e a HSA buscando compreender a diferença de especificidade encontrada nos dois sítios de ligação da proteína. Além disso, utilizamos sondas de diferentes hidrofobicidade para verificar a influência desta propriedade na interação de compostos com a albumina. Os resultados de rendimento quântico, tempo de vida, anisotropia de fluorescência e dicroísmo circular mostraram a maior afinidade entre os aminoácidos dansilados de sítio II e a HSA. Os aminoácidos dansilados de sítio II também apresentaram maiores valores de constante de associação. Os estudos de calorimetria de titulação isotérmica, ITC, confirmaram a menor afinidade dos dansilados de sítio I com a HSA. A aplicação da dansil-glutamina (DGlu) como sonda do sítio I da HSA evidenciou que a carga positiva encontrada nas estruturas dos demais dansilados de sítio I parece prejudicar suas ligações com a proteína. Os estudos envolvendo ligantes com diferentes hidrofobicidade mostraram que o ligante mais hidrofóbico apresenta maior afinidade com a albumina. Neste caso, a interação é entropicamente dirigida e por isso o critério envolvendo a temperatura na distinção do tipo de quenching não foi o mais adequado. Os estudos de docking e dinâmica molecular confirmaram os achados experimentais. Em conclusão, a menor afinidade dos aminoácidos dansilado de sítio I em HSA está relacionada a maior energia que esses compostos devem ter para acessar esta cavidade da proteína. Isso ocorre devido a uma repulsão eletrostática entre aminoácidos Lys195, Lys199, Arg218 e Arg222 na entrada do sítio I e a carga positiva dos aminoácidos dansilados do sítio I.