Desenvolvimento e padronização de um sistema de autoindução da expressão gênica em Bacillus subtilis - Corrêa, Graciely Gomes [UNESP] (2019)
Os métodos de indução da expressão gênica disponíveis para linhagens bacterianas envolvem a adição de compostos indutores ao meio de cultura (por exemplo, isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo, xilose e arabinose), o que é indesejável para linhagens industriais, pois encarece o processo produtivo. Já a utilização da expressão constitutiva, alternativa à indução, pode ocasionar stress metabólico durante a fase lag de crescimento quando são utilizados promotores fortes. O objetivo do trabalho foi construir e padronizar um novo modelo de indução da expressão gênica para linhagens bacterianas industriais. O novo modelo de autoindução baseado no sistema de quorum-sensing bacteriano, permitindo que a célula se automonitore e induza a expressão gênica durante a fase exponencial de crescimento, eliminando assim não só a necessidade de adição de composto indutor como a necessidade de monitoramento da densidade celular pré-indução. Realizou-se amplificação e clonagem dos genes luxR e luxI, com e sem caudas de histidina, e suas respectivas sequências regulatórias de Aliivibrio fischeri, em plasmídeo contendo os genes responsáveis pela bioluminescência ou fluorescência com códons otimizados para Bacillus subtilis. Em seguida, foi realizada transformação e a integração do plasmídeo no cromossomo de B. subtilis. A funcionalidade do sistema foi avaliada em diferentes etapas de crescimento microbiano com o auxílio de um leitor de microplacas durante intervalos regulares. O sistema de autoindução mostrou-se funcional em B. subtilis, com indução acentuada da expressão do gene repórter, disposto downstream ao promotor Plux, durante a fase exponencial de crescimento. Verificou-se ainda que a inserção do sistema baseado no quorum-sensing não afetou o crescimento do microrganismo significativamente. Foram desenvolvidas e testadas dez otimizações do sistema inicial, com alterações na sequência do promotor Plux. Através dessas otimizações, construímos linhagens com diferentes níveis de expressão do sistema de autoindução e força do promotor variável. Ao caracterizar os sistemas, foi constatado alto nível de modularidade, podendo ser utilizados em diferentes linhagens de B. subtilis, diferentes contextos genéticos e para a produção de diferentes produtos. O modelo de indução desenvolvido se mostrou funcional e modular e poderá ser adaptado a diferentes espécies e compostos, configurando uma nova ferramenta para a biologia sintética.